1 南方医科大学南方医院肿瘤科
2 南方医科大学南方医院呼吸科
3 美国阿肯色大学医学院基因治疗中心
尤长宣1 苏 瑾2 廖旺军1 张军一 1 郑航1 Yong Liu3 Paul L Hermonat3 罗荣城1
摘要 目的：探讨以乳腺癌特异抗原BA46 基因转染乳腺癌患者树突状细胞（DC）诱导特异细胞免疫的可行性。方法：取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞(DC 前体细胞)，将细胞分为基因转移组及对照组，基因转移组感染携带BA46 基因的重组腺相关病毒rAAV/BA46/Neo，对照组以293 细胞冻融液刺激，两组细胞均采用重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素4（IL-4）诱导DC前体细胞成熟。第7 天，收集悬浮细胞（DC），显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析DC 的表面标志CD80、CD86、CD40 的表达情况；另取该DC 与T 细胞按1：20 比例混合，含5%人血清蛋白的AIM-V 为培养基，同时加入IL-2与GM-CSF，共育7 天，诱导获得细胞毒性T淋巴细（CTL），取BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T 为靶细胞，采用51Cr 释放法测量杀伤效率，同时以流式细胞仪检测CTL 群体中CD8/CD4和CD8/CD56的比值。结果：BA46基因转导的DC表面标志CD80、CD86、CD40的表达均明显高于对照组DC，所激活的T 细胞对BA46 阳性的乳腺癌细胞株Hs578T 有很好的杀伤效果，此杀伤具有抗原特异性和MHC限制性，且该T细胞中CD8/CD4和CD8/CD56的比值均明显高于对照组（裂解物冲击DC所激活的T细胞）。结论：BA46基因转导成功制备DC，并诱导特异的CTL，为乳腺癌的DC基因转导疗法打下基础。
关键词 树突状细胞；BA46；基因转移；乳腺癌
树突状细胞（DC）是人体内功能最强大的抗原递呈细胞，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用，采用体外培养DC，特异肿瘤抗原刺激制成DC瘤苗，免疫机体从而激发特异的细胞免疫有望成为一种理想的肿瘤治疗手段[1， 2]。此疗法的关键是获得特异的肿瘤抗原，并将该抗原转导DC。乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，BA46几乎在所有的乳腺癌细胞表达，而在乳腺以外的正常组织内不表达，以其抗原肽免疫转基因鼠，可在其身上诱导出特异的细胞免疫[3]，它是乳腺癌DC治疗非常理想的肿瘤抗原。因此，本研究以腺相关病毒（AAV）以载体，成功制备高滴度的携带BA46 基因的重组腺相关病毒（rAAV/BA46/Neo 病毒）[4]。在此基础上，取人外周血单个核细胞（DC 前体细胞），体外培养，以rAAV/BA46/Neo病毒转染DC前体细胞，GM-CSF、IL-4和TNF-a诱导DC成熟，加入T细胞，GM-CSF和IL-2 诱导，最终获得针对BA46 的细胞毒性T 淋巴细胞（CTL），并检测该CTL 对BA46 阳性的乳腺癌细胞株Hs578T的杀伤效果及CTL内CD8/ CD56 和CD8/CD56的情况，探讨此基因转移法制备DC，诱导CTL用于治疗乳腺癌的可行性。
一、 材料与方法
(一) 材料
1. 病毒：重组乳腺癌BA46 基因腺相关病毒（rAAV/BA46/Neo）由作者于阿肯色大学医学院基因治疗中心制备，病毒滴度为1×1010个病毒颗粒/ml[4]。
2. 主要试剂：AIM-V培养基购自GIBCO invitrogen公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自Sigma 公司；AIM-V（R）无血清淋巴细胞培养基购自GIBCO Invitrogen 公司；GM-CSF 购自Immunex 公司；IL-4 购自R&D SYSTEMS公司；Anti-CD40 抗体购自Immunotech公司；anti-CD80购自Becton-Dickinson公司；anti-CD86，anti-CD4，anti-CD8，anti-CD56 均购自Pharmingen公司。
(二) 方法
1．人外周血DC 的培养：取健康人外周血50ml，Ficoll 分离，收集淋巴细胞，以AIM-V 为培养基，调节细胞浓度为109/ml，培养于6孔板，每孔2.5ml，在37℃、5%二氧化碳孵箱中培养贴壁5h，轻轻洗去悬浮的淋巴细胞，取贴壁的单个核细胞，每孔加2.5ml 含GM-CSF（终浓度为800U/ml）的AIM-V培养基，将细胞分为基因转移组和对照组（未感染病毒组），基因转移组每孔加rAAV/BA46/Neo病毒液0.5ml，感染5h后换液为每孔3ml 含GM-CSF（终浓度为800U/ml）的AIM-V培养基，对照组每孔只加293细胞冻融液0.5ml。第2 天半量换液，于第3 天全量换液为含GM-CSF9（终浓度分别为800U/ml）和IL-4（终浓度为1000U/ml）的AIM-V培养基。而后隔天半量换液，培养基均为含GM-CSF（终浓度分别为800U/ml）和IL-4（终浓度为1000U/ml）的AIM-V，第7天收集细胞，计数，光学显微镜下观察DC形态。
2．CTL 的诱导：在6 孔板内，以含5%人血清的AIM-V 为培养基，按DC：T 细胞＝1：20 的比例混合DC和T细胞，同时加入GM-CSF（终浓度分别为800U/ml）和IL-2（终浓度为20U/ml）和IL-2（终浓度为20ng/ml），共培养7 天，期间每隔1 天均半量换液。
3．FACS 分析所制备的DC 的表面标志和CTL 亚群比例：分别取细胞数为106/管的基因转移组DC和对照组DC置于流式细胞仪专用试管中，每组取4管，PBS洗涤2 遍后，100μl重悬细胞，分别加入下列带FITC的鼠源性单抗：对照isotype、anti-CD40、anti-CD80、anti-CD86，暗处反应45min，PBS洗涤2遍后，流式细胞仪检测其细胞表面标志表达情况。以同样的方法处理CTL，加入对照isotype和带FITC的鼠源性单抗anti-CD4、anti-CD56 以及对照isotype 和带PE 的鼠源性单抗anti-CD8、流式细胞仪检测其细胞表面标志表达情况并计算CD8/CD4和CD8/CD56 的比值。
4．51Cr 释放法测量DC 激活的T 细胞对BA46 阳性细胞株的杀伤效率[5]：分别以BA46 基因转移组ＤＣ激活的T 细胞和对照组ＤＣ激活的T 细胞为效应细胞，收获对数生长期的BA46 阳性的乳腺癌细胞株Hs578T 为靶细胞，调整细胞浓度为2×106 /ml，取0.5ml 细胞悬液，加入100μCiNa251CrO4，37℃共育2 小时。洗涤后稀释至106 /ml，在U形板中炒100μl细胞悬液，按照20：1 的效靶比加入CTL细胞。37℃共育6 小时。收获100μl 上清，g计数仪计算，按下列公式计算杀伤率：
同时取K562 细胞为靶细胞进行同样的细胞毒试验以研究T细胞的非特异杀伤情况。同时在基因转移组CTL 杀伤Hs578T 的细胞毒试验中增加一组实验，在靶细胞与Na251CrO4共育并洗涤后，加入HLA-I类抗体W6/32(终浓度为50μg/mL)共育1 小时，使其MHC受到封闭后，再进行细胞毒试验，研究T细胞杀伤的MHC限制性。
二、 结果
(一) 携带有BA46基因的重组rAAV/BA46/Neo质粒结构示意图（图1）
AAV 的rep及cap基因被BA46和Neo基因取代，保留两端的反向未端重复序列ITR，BA46基因采用P5 启动子，Neo基因采用SV40 启动子。
(二) 基因转移组成熟DC形态（图2）
第7 天，光镜下观察基因转移组DC，可见DC明显比T淋巴细胞大，外形不规则，细胞表面有大量长短不一的树突，呈现典型的DC形态。
