第四军医大学西京医院呼吸内科（710032）
任新玲 吴昌归 李志奎 李树钧 张 艰 陈卫强 李圣青
基础部生物化学与分子生物学教研室 付海京
免疫学教研室 鲍 炜 杨安钢
第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所 钱桂生
HER2 是由HER2/neu 基因编码的一种酪氨酸蛋白激酶，具有自动磷酸化作用，属表皮生长因子受体（EGFR）家族。乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌（NSCLC）等恶性肿瘤存在HER2/neu 过表达，30%NSCLC 存在HER2/neu 过表达，与肿瘤的发生、转移、肿瘤血管形成、抗凋亡及化疗耐药等有关。针对HER2/neu 的肿瘤靶向和基因治疗取得了令人瞩目的成就，但是近期HER2 单抗Herceptin 针对肺癌Ⅱ期临床研究并未获得类似乳腺癌、前列腺癌那样的预期疗效，患者无明显获益，使研究者陷入困惑。可见肺癌有其自身特点，有必要对HER2/neu 在肺癌中的作用进行进一步研究。通过RNA 干涉抑制肺腺癌细胞SPC-A-1 HER2/neu 过表达，观察对肺癌细胞周期、增殖及集落形成能力的影响。以人HER2/neu 序列为模板选择最佳干涉位点，首先构建不带筛选标记pSUPER-siHER2 重组质粒，再将H1 启动子连同编码siRNA 的模板序列用BglⅡ和HindⅢ双酶切出，连接入去除CMV 启动子的pcDNA3.0 载体，构建带新霉素抗性筛选标记pcDNA3.0-siHER2 重组质粒，经酶切鉴定正确后，取对数生长期贴壁细胞SPC-A-1，使用LipofectamineTM2000 进行转染，400μg/ml G418 筛选，3 周后挑取单集落扩大培养，收集建系单集落株，通过RT-PCR 和Western Blot 检测HER2/neu 表达；FCM 分析细胞周期；MTT 法观察细胞增殖，绘制细胞生长曲线；平板集落形成实验检测肿瘤细胞的集落形成能力。结果表明成功构建地HER2/neu-siRNA重组质粒，稳定转染靶细胞后可显著降低肺癌细胞HER2/neu表达；与亲代细胞比较，G0/G1 期细胞增加14.2%，S 期细胞减少11.2%；细胞生长速度减慢，集落抑制率达到49.0%。针对HER2/neu 的siRNA 可以显著降低肺腺癌细胞HER2/neu 过表达，肿瘤细胞阻滞于G0/G1 期，造成细胞增殖减慢，表明HER2/neu 原癌基因参与了NSCLC 细胞周期调控，而G0/G1期是肿瘤细胞放化疗最敏感的时期，HER2/neu 的过表达可能参与了NSCLC 的耐药。同时抑制HER2/neu 表达后细胞增殖速度减慢，集落形成能力下降，表明HER2/neu 在NSCLC 形成和发展中扮演重要角色。本实验挑取单克隆株传代培养，在1～4 个月时间，反复多次RT-PCR 和Western blot 证实能够持续抑制HER2/neu 表达，显示重组质粒可以在靶细胞内稳定表达数月以上，从而有效地长时间抑制HER2/neu 表达。针对HER2/neu 的siRNA 技术，有望为过表达HER2/neu 的NSCLC 基因治疗提供一种有效的治疗手段。
