上海交通大学医学院附属仁济医院肿瘤科 张凤春 林叔陈 宋彩丽 徐迎春
张凤春教授
一、 引言
干细胞是具有自我更新、无限增殖及多向分化能力的细胞群体。最近越来越多的证据显示肿瘤组织及肿瘤细胞系中的细胞存在着等级性，即存在着不同分化阶段的的细胞，这些细胞在性质及功能上存在着诸多差异，其中有一部分的肿瘤细胞充当干细胞的角色，在启动肿瘤形成和维持肿瘤生长中起决定性作用命名为肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)。Blair 等[1]的研究则使人们开始关注肿瘤干细胞与正常干细胞的关系。他们发现能在体外形成白血病克隆的细胞、能在免疫缺陷鼠体内形成急性髓系白血病的细胞均表达正常造血干细胞的标志CD34，但与正常造血干细胞不同，不表达Thy-1。2003 年，Al-Hajj 等人[2]则第一次从实体瘤——乳腺癌组织中分离出乳腺癌干细胞。
二、 乳腺癌干细胞的分离
一直以来对乳腺癌干细胞缺乏有效的分离方法，因此对其生物学行为的研究也比较缓慢。最近人们采用了各种策略分离出乳腺癌干细胞。
1. CD44＋CD24－/lowlin－
CD44是一种归巢细胞粘附分子，是一种I型跨膜糖蛋白分子，其配体是透明质烷。近年来CD44被用于乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等肿瘤干细胞的分离。Al-Hajj等[2]从乳腺癌病人组织中分离出CD44＋CD24－/lowESA＋lin－群细胞，这群细胞只需200个就可以在NOD/SCID鼠中5～6个月后形成大约1cm的肿瘤，而CD44＋CD24-/lowESA－lin－细胞、CD44＋CD24＋细胞、CD44－细胞、CD24＋细胞则无致瘤性或致瘤性低。与未分选的细胞相比，CD44+CD24-/lowESA＋lin-群细胞致瘤性提高了50倍。
2. Hoechst33342染料排斥法
Hoechst33342是一种DNA增补性染料，能结合到DNA的AT丰富系列的小沟处，干细胞及肿瘤干细胞因带有ABC转运蛋白而能将染料泵出而表现为染料暗淡的特征而被分离出来，所分选出来的染色暗淡的细胞被称为侧亚群(side population，SP)细胞，而大部分深染的细胞被称为non-SP细胞或MP细胞。Kondo等[3]采用此方法鉴定出MCF-7乳腺癌细胞系中SP比例为2.0%。然而因为SP与non-SP部分相连在一起，因此带有一定的主观性。Patrawala等[4]改进了这种分离方法，他们使用了Coulter Epics流式细胞仪，这种细胞仪能将SP与non-SP分为独立的两群，并采用HL60-dox作为对照组，HL60不含SP细胞，而HL60-dox则含大于90%的SP细胞，将HL60-dox滴定到HL60细胞中，并进行流式分析以检测该系统的灵敏性，之后检测发现MCF-7中SP比例为0.2%。产生SP表型的主要原因是因为高表达ABCG2[5]。加入verapamil之后SP比例大大减少，奇怪的是verapmi并不抑制ABCG2的功能，而只抑制P-糖蛋白的功能[6]，因此为什么加入verapamil可以导致SP比例减少机制不明。
Hoechst33342染料排斥法对染色流程要求比较严格，染色温度、染色时间、verapamil浓度等对实验结果影响很大，样本制备的微小差异也可能对实验结果造成重大影响。Kondo等[3]采用Hoechst33342染料方法发现C6胶质瘤细胞中只含0.4%的SP，然而最新的研究表明大部分的C6胶质瘤细胞是肿瘤干细胞，具有自我更新能力及致瘤性，采用Hoechst33342染色法会导致染料在non-SP比SP聚集更多有毒性的Hoechst染料，从而可能造成non-SP自我更新能力低、致瘤性低的假象[7]。因为染料排斥法具有不需要寻找特定的肿瘤干细胞特异的表面分子标志物等优点，已经成为目前广泛使用的多种肿瘤干细胞分离方法，然而其可靠性有待进一步评价。
3. CD55
Hoechst33342染料排斥法的上述缺点促使人们寻找一种无染料的简便的肿瘤干细胞分离系统。CD55是一种补体衰变加速因子，与C3转化酶结合，阻止了C3b的沉积，并抑制了攻膜复合物的形成，从而使肿瘤细胞逃脱补体的攻击。近年的研究表明CD55与肿瘤细胞的活动度、新生血管形成、细胞凋亡的解救、肿瘤的致瘤性、肿瘤的侵袭及转移等有关[8]。Xu等人[9]发现从MCF-7中分离出的CD55hig、CD55low分别落在SP、MP部分。去除CD55hig群的MCF-7细胞后，大部分的SP消失了。提示采用CD55抗体可以替代Hoechst33342染料排斥法。克隆形成实验显示CD55hig的克隆形成效率高于CD55low，而且CD55hig细胞具有进一步分化的能力。CD55在细胞系中的SP、MP的表达模式具有普遍性，在MDA-MB-231乳腺癌细胞系、Lovo、RCM-1结直肠腺癌细胞系、TIG-1–20肺成纤维细胞系等均观测到类似现象。因此CD55hi群细胞可能是一群具有干细胞、肿瘤干细胞样性质的细胞。但作者并未对其体内致瘤性进一步评价。而且一些细胞如PC3前列腺癌细胞不含SP细胞，DLD1细胞的SP、MP表达相似水平的CD55。为什么CD55hig可以替代SP，ABCG2与CD55的相互间调节关系如何有待进一步探讨。
三、 乳腺癌干细胞的体外培养
肿瘤干细胞既能发生对称性分裂，引起肿瘤干细胞的自我更新，也能够发生非对称性分裂产生干细胞与祖细胞，后者进一步分化成后代细胞。因此如何使分选出来的干细胞只发生对称性分裂产生干细胞本身，而不发生分化是一个值得深入探讨的问题。研究表明在无血清的含bFGF、EGF的培养液下培养可以乳腺癌细胞可以形成微球体，这种微球体富含CD44＋/CD24-/low细胞，不表达分化腔上皮、肌上皮等分化标志物，在分化条件下培养具有多系分化的能力，致瘤性也明显提高，提示通过微球体培养成功的分离出了乳腺癌干细胞，并成为乳腺癌干细胞体外培养的一种常规方法[10， 11]。
四、 乳腺癌干细胞与信号转导通路
目前的观点认为肿瘤干细胞是处在一系列信号传导通路的调控网络中。Wnt、Notch、Hedgehog等通路参与着许多正常干细胞的自我更新过程，对许多肿瘤包括乳腺癌的发生发展起着不可磨灭的作用。这些信号通路在调控着乳腺癌干细胞的过程中也可能发挥着重大作用。
研究表明，Wnt 通路的活化促进了乳腺干细胞的自我更新，引起了乳腺干细胞比例的增加[12， 13]。乳腺癌干细胞高表达wnt-1、下游分子β-catenin[4， 14， 15]。COMMA-D β－geo (CDβgeo)乳腺癌细胞系转染β-catenin 后形成乳腺微球体的比例增加了。这些结果表明Wnt 通路的活化可能通过干扰乳腺干细胞正常的自我更新，优先诱导乳腺干细胞异常增殖、转化，最终导致乳腺肿瘤的形成。对Wnt-1 转基因鼠干细胞比例、干细胞标志物、分化标志物的研究支持了这种假说[16]。
Notch通路对乳腺癌干细胞的调节作用尚不明确。但对乳腺干细胞的研究发现，乳腺干细胞高表达Notch1、Notch4及Notch靶基因Hesr-1[17]，而乳腺干细胞Notch通路的活化则导致了乳腺微球体形成效率增加，而Notch信号的活化对分化细胞则无作用[18]。Patrawala等[4]采用RT-PCR发现从MCF-7乳腺癌细胞系中分离出的SP与non-SP相比表达更高水平的Notch-1。这些结果提示Notch信号可能参与调节乳腺癌干细胞的自我更新。
Hedgehog在乳腺干细胞、乳腺癌干细胞高表达[19]，但对MCF-7乳腺癌细胞系的研究则发现SP细胞与non-SP细胞表达相似水平的Hedgehog信号途径活化受体Smoothened[4]。Hedgehog在调控乳腺干细胞的作用研究报道不一。Liu S等[19]发现Hedgehog信号活化后增加了乳腺微球体起始细胞的数量及乳腺微球体的尺度，而Moraes等[20]则发现Hedgehog活化后虽可使微球体形成效率增加，但体内试验显示再造乳腺乳腺的频率减少，提示Hedgehog信号的活化可能促进了乳腺干细胞向祖细胞分化，增加了能在不依赖于贴壁的生长条件下分裂胜任细胞的存活或活力，而不增加再生干细胞的比例。
SDF-1－CXCR4轴在肿瘤转移中的作用备受关注。操纵乳腺癌细胞系MDA-MB-435s、MDA-MB-231的SDF-1的基因表达可以改变乳腺癌的侵袭转移潜能[21]。许多正常干细胞高表达CXCR4，而在骨髓、淋巴结、肌肉、肺等来源的成纤维细胞、肝细胞、肾细胞及中枢神经系统则表达/分泌SDF-1。SDF-1－CXCR4轴介导造血干细胞的归巢、增强胚胎干细胞、神经干细胞的趋化性。肿瘤干细胞的转移与正常干细胞的运输可能采取相同的机制，即通过SDF-1－CXCR4轴的作用[22]。有研究表明，肿瘤组织的成纤维细胞，与远离肿瘤组织的正常成纤维细胞相比，表达、分泌更高水平的SDF-1[23]。乳腺干细胞与分化细胞相比高表达CXCR4[24]，我们推测乳腺癌干细胞与分化细胞相比也高表达CXCR4，赋于了其更高的转移潜能；肿瘤来源的间质细胞表达、分泌SDF-1，与乳腺癌干细胞表面的CXCR4相互作用促进了乳腺癌干细胞由一个组织转移到另一个组织，并在转移灶增殖、分化，形成肿瘤转移。
Gata-3是一种转录因子，在多种器官中表达，与胚胎发育有关，与胎肝造血、中枢神经系统发育、T细胞发育、肾发育等有关。Asselin-Labat等[25]发现gata-3与乳腺发育有关，Gata-3的缺失可引起泡状细胞发育减少、功能减低，而CD29lowCD61＋腔上皮祖细胞的比例的增加；而在CD24＋CD29high干细胞群诱导gata-3高表达则导致了干细胞向泡状细胞分化增加。提示gata-3在调节乳腺祖细胞的分化起了重要作用。Gata-3还参与了乳腺肿瘤的进展，在腔上皮A、B亚型中表达升高。Gata-3在调节乳腺癌干细胞的分化过程中是否起作用有待进一步研究明确。
五、 乳腺癌干细胞与微环境
在多种组织中已经证实存在壁龛(niche)。壁龛由间质细胞等壁龛支持细胞及细胞外基质组成。它保持着干细胞处于休眠状态；阻止了干细胞的分化；促进了干细胞采取了不对称分裂方式，产生一个干细胞留在壁龛内，而另一个子代细胞逃出壁龛，以保持壁龛中干细胞数量的稳定。Chepko等[26]第一次证明了在乳腺组织中也存在壁龛。他们对鼠乳腺上皮进行电子显微镜分析，发现小的明细胞(推测的乳腺干细胞)通过基底膜与临近的腔上皮细胞、肌上皮细胞隔绝开来，形成了特殊的结构，即壁龛。
很早以前人们就注意到肿瘤与微环境的相互作用。所谓肿瘤微环境包括间质细胞、细胞外的基质及血管、炎症细胞，其中肌成纤维细胞是间质细胞中最主要的细胞成分。肿瘤的发生与其周围组织细胞及细胞外基质等微环境的改变密切相关。将早期阶段的胚胎或胚胎干细胞转移到成人宿主的异位可以诱导出胚胎性癌。EC细胞被引进到早期胚胎后，能够表现为正常胚胎细胞[27， 28]。衰老的人纤维母细胞能促使临界恶变的乳腺上皮细胞不可逆性的转化为具有侵袭性的、完全恶性行为的肿瘤细胞[29]，而年轻的增殖迅速的非肿瘤细胞如胚胎干细胞可抑制肿瘤细胞的生长[30]。乳腺癌细胞可诱导邻近的成纤维细胞MMP-2、MMP-9基因表达改变，形成了一个促进肿瘤转移的微环境[31]。
可以设想，在肿瘤组织中肿瘤细胞，特别是肿瘤干细胞，与微环境相互诱导，产生了一些功能性的壁龛，壁龛的中心是肿瘤干细胞，而周围则是分化的肿瘤细胞、肌成纤维细胞、内皮祖细胞、细胞外基质等构成的微环境。它保护着肿瘤干细胞，免于抗癌药物、放射线的攻击，通过信号传导通路调节着肿瘤干细胞的自我更新、分化、凋亡，影响着肿瘤干细胞的迁徙与转移，通过招募内皮祖细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞到肿瘤细胞周围，形成肿瘤的间质，促进肿瘤的血管生长，促进肿瘤的进展。最近，Calabrese等[32]证实了在脑肿瘤组织中存在着血管性壁龛，后者调节着脑肿瘤干细胞的自我更新。
六、 乳腺癌干细胞与化疗疗效
肿瘤干细胞因高表达有ABCG2等ABC转运体，能将化疗药泵出，而被认为对化疗具有抵抗性。化疗药杀死了占大多数的分化细胞，而留下了少数的肿瘤干细胞。成为日后复发的根源。Liu等[33]将ESA＋CD44＋CD24-/lowlin－的致瘤性乳腺癌干细胞与正常乳腺上皮细胞，进行差异表达分析，发现186个基因的表达有显著不同，将这些基因命名为“侵袭性”基因信号(IGS)。对284例具有死亡、转移高风险的乳腺癌病人(依据NIH指标来判断)需要常规给予化疗者，依据IGS的表达状况分为IGS阴性者(共60个病人)及IGS阳性者(共224个病人)，前者13%发生了转移，10年无转移率为81%；后者41%发生了转移，10年无转移率为57%。对185个乳腺癌病人没有给予化疗者，依据IGS的表达状况分为IGS阴性者(共42个病人)及IGS阳性者(共143个病人)，前者10年复发率为12%，后者10年复发率为43%。这些结果表明IGS的状态对于判定乳腺癌患者能否从化疗中受益具有指导意义。
七、 乳腺癌干细胞对放疗抵抗性
一直以来人们推测肿瘤干细胞对放疗具有抵抗性。Phillips等[10]发现MCF-7在干细胞条件下培养形成的乳腺微球体(MCF-7S)与MCF-7相比，经过放射性照射后形成的克隆更容易存活，γH2AX、反应性氧簇(ROS)的水平也提示前者更不容易发生DNA损伤。另一项研究也表明，MCF-7细胞照射后SP比例增加了，CD24＋CD29＋Lin－群细胞(在鼠的乳腺中被认为是乳腺干细胞)的比例增加了[34]。引起放疗抵抗性的机制有Notch通路的活化[10]、Wnt-β-catenin－survivin信号的活化[35]。然而，这些研究还只是停留在体外实验上，体内的结果还有待进一步验证。
八、 乳腺癌干细胞与缺氧
最新研究表明，干细胞壁龛主要存在于低氧环境中[36]。低氧的刺激可诱导低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达，导致前脂肪细胞分化受阻[37]，诱导Notch1等干细胞相关基因的表达，引起缺血、缺氧条件下神经干细胞的扩增。所有的实体瘤，包括乳腺癌，都包含低氧区。而缺氧诱导乳腺癌细胞高表达CXCR4[38]、赖氨酸氧化酶(LOX)[39]，引起乳腺癌侵袭转移增加。Sansone等[40]的研究表明低氧诱导了MCF-7乳腺癌细胞高表达哺乳动物长寿子P66Shc，从而避免了低氧条件下基因组DNA的损伤。培养形成的微球体在低氧环境下也观察到类似现象。在低氧下，P66Shc能够诱导Notch-3、Jagged-1的高表达，而采用予SHC siRNA处理后，则使Notch-3、Jagged-1表达减少。提示p66Shc/Notch-3/Jagged-1轴对于乳腺癌细胞在缺氧下的存活具有重要作用。
我们设想在体内乳腺癌干细胞也存在于低氧的壁龛中，在这种微环境下乳腺癌干细胞及其壁龛支持细胞高表达HIF-1，保持着乳腺癌干细胞的未分化状态，并通过下游分子CXCR4、LOX，调节着乳腺癌干细胞的侵袭、转移潜能。而且，缺氧诱导了P66Shc等信号分子的活化，并诱导Notch等干细胞调节信号的高表达，促进乳腺癌干细胞发生自我更新。
九、 乳腺癌干细胞与肿瘤侵袭转移
Balic等人[41]对早期乳腺癌病人的骨髓中具有播散性肿瘤(DTC，CK染色阳性的代表含有DTC)的标本进行组化分析，发现在肿瘤微小转移灶中所含的肿瘤干细胞占有相当的比例。Sheridan等[42]对13种乳腺癌细胞系研究发现，CD44＋CD24－群比例高的细胞系表达更高水平促侵袭相关基因，体外侵袭试验也提示侵袭能力更强。从TMD-436 细胞分离出CD44＋CD24-群细胞、CD44＋CD24＋群细胞，发现前者体外侵袭能力更强，但促侵袭基因只有IL-8表达水平更高，而MMP-1、UPA、IL-6、36B4等则无显著差别。然而只有一小部分CD44＋CD24-比例高的细胞系可在肺内形成转移灶，提示CD44＋CD24-的表型与侵袭相关，但还不足以预测是否容易发生转移。
十、 乳腺癌干细胞与预后
Liu等[33]的结果具有深远意义。他们发现IGS阳性的乳腺癌病人10 年整体存活率为62%，无转移存活率为54%，IGS阴性者10 年整体存活率为98%，无转移存活率为82%。IGS与死亡、转移的风险的相关性是独立于肿瘤大小及淋巴结状态的。结合IGS 与创伤反应(WR)信号对于判断10 年无复发存活率具有重大意义。虽然IGS 是通过对比乳腺癌干细胞与正常乳腺上皮细胞得出的基因信号，但分析肺癌、成神经管细胞瘤、前列腺癌病人的结果发现，IGS 阳性组与IGS 阴性组的5 年整体生存率或无复发生存率差异具有统计学意义。而Abraham等[43]采用免疫组化方法发现CD44＋CD24-/low细胞比例大于10%与小于10%对无事件存活率、整体生存率无明显相关性。两项研究的差异可能与他们采用的方法有关。
十一、 展望
人们采用了多种方法从许多肿瘤组织或细胞系中分离出肿瘤干细胞，对于研究它们的生物学行为及其调控机制，最终靶向根除肿瘤干细胞具有重要意义。然而仍然有许多遗留的问题。尽管ABCG2作为引起SP表型的主要原因，但是 ABCG2＋细胞与ABCG2-细胞在动物体内具有相同的致瘤性，且ABCG2＋细胞形成的肿瘤可以产生ABCG2-的细胞，ABCG2-细胞形成的肿瘤可以产生ABCG2＋细胞，从这个意义上来说ABCG2＋与ABCG2－的细胞都具有体外分化能力，并具有体内成瘤的能力[4]。原先认为脑肿瘤干细胞表达CD133，而Beier等[44]发现不同亚型的胶质瘤的肿瘤干细胞生物学特性不一样，其中培养形成悬浮的微球体的脑肿瘤干细胞表达CD133＋，而培养形成贴壁的微球体的脑肿瘤干细胞不表达CD133，还有的培养不能形成微球体，且不表达CD133，其肿瘤干细胞的标志有待进一步鉴定。MCF-7、T47-D等ER阳性的乳腺癌细胞系中CD44＋CD24－的比例为0%，而ER阴性的乳腺癌细胞系如MDA-MB-231则高达85%，SUM1315高达97%[42]，而且在乳腺癌组织中并不是所有的样本体外培养都可形成微球体[11]，这些结果促使我们做出这样的假想：乳腺癌也可能类似于脑肿瘤，不同亚型的乳腺癌的肿瘤干细胞群体不一样，从而造成不同亚型的乳腺癌基因表达、侵袭、转移、激素敏感性、预后等差异。
因为正常组织结构的维持有赖于机体严格的时空调控，对癌症的认识必须从一个新的视角去把握，我们设想存在通过改变肿瘤干细胞的微环境，改变其内部异常的信号传导从而诱导其向正常干细胞转化的可能性。r-分泌酶，介导了Notch受体的膜内溶蛋白性裂解，参与了Notch信号的起始活化过程。GSI-18作为r-分泌酶抑制剂，体外试验表明抑制了肿瘤干细胞的增殖、诱导了肿瘤干细胞凋亡、分化，动物试验表明减少了致瘤性，且在随后数月的随访中未观察到明显的副反应，表明潜在治疗肿瘤的运用价值[45]。通过开发出调节肿瘤干细胞的分子制剂应用于肿瘤治疗，有望达到根治肿瘤的目的。通过寻找正常干细胞与、肿瘤干细胞不同的信号传导途径或者能引起不同效应的同一信号传导途径对于靶向杀伤肿瘤干细胞，而不损伤正常干细胞具有重要指导性意义。
随着人们对肿瘤干细胞生物特性及其调控机制认识的深入，我们深信对于肿瘤的治疗必将揭开新的历史篇章。
参考文献(略)
