二代测序：突破和障碍并存
二代测序（NGS）是液体活检中常用的一种基因检测技术。作为一种高通量的测序技术，NGS 可对数千个基因做多类型组学分析，其对临床肿瘤治疗的积极作用让人耳目一新，但仍然存在一些应用的局限性。
2016 年 3 月 4 日，第 13 届中国肺癌高峰论坛在广州召开，来自广东省人民医院、广东省肺癌研究所的吴一龙教授就「液体活检在肺癌应用领域的六点共识」进行了学术报告，分享了 NGS 技术在肺癌精准医疗领域的应用。
NGS 助力肿瘤精准治疗突破
「共识」认为，用于发现未知基因，探索疗效检测、预后判断和发现耐药机制等，液体活检技术建议使用 NGS。
对于 EGFR 阴性的肺癌患者，使用 NGS 仍然可以检测未知基因突变谱。也有学者发现，CTC 分型亚群可以作为培美曲塞的用药参考，筛选出最佳获益人群：对于特定的 CTC 分型亚群，培美曲塞一线化疗有效率可以提升至 75%，甚至高于大部分靶向药物，这在一定意义上也属于靶向、精准治疗的范畴。
NGS 也可以用于靶向治疗疗效的动态监测。FAST ACT 2 研究提示，对于 EGFR 突变且接受一线 EGFR-TKI 治疗的患者，C3 pEGFR 突变状态可能是疗效预测因子，C3 pEGFR 突变阴性的患者，中位 PFS 和中位 OS 可分别达到 16.6个月、32.4 个月，而突变阳性者仅为 7.8 个月和 17.7 个月。
NGS 技术使各种基因位点的检测和扩增成为可能，从而有助于从基因层面对 TKI 耐药机制进行深入探索。一项研究发现，对于 EGFR T790M 突变阳性的非小细胞肺癌患者，获得性 EGFR C797S 变异可以影响肿瘤对 AZD9291 的耐药性。
最近发表于 NEJM 的一篇病例报道也发现，对于克唑替尼初始治疗耐药的患者，ALK L1198F 点突变可导致 Lorlatinib 的耐药，但也同时使得肿瘤对克唑替尼恢复敏感性。当然小型研究和个案报道的证据尚不足以支持NGS应用于临床，但NGS对于TKI耐药机制的发现可以指导相应临床试验的设计，探索对于TKI耐药患者的治疗选择。
障碍和突破并存 NGS 仍需努力
尽管 NGS 的优势有目共睹，但其广泛应用仍存在一定障碍和限制。「共识」对 NGS 的意见使用了「建议」而不是「推荐」，正是希望其目前仍主要限于科学研究。多数与会专家认为，临床开展 NGS 的最主要目的是寻找晚期患者的主要驱动基因并进行靶向治疗，以及尝试寻找耐药的分子变异靶点和治疗对策。
「共识」指出，液体活检包括循环肿瘤细胞（CTC）和循环肿瘤DNA（ctDNA）可能用于肺癌早期诊断和复发检测，但目前同样仅限于科研探索。多数肺癌患者 ctDNA 浓度小于 0.5%，新的检测技术使早期肺癌的诊断成为可能。
一家名为 GRAIL 的公司称，「将通过血液筛查发现那些没有症状的早期癌症患者」，并计划在未来 3 年内将肿瘤全面检测推广开来。
但也有学者在 Lancet Oncol 上发表评论认为，液体活检作为通用癌症筛查还存在一些疑问和障碍：首先，在增加检测方法敏感性的同时，假阳性率也会增高；其次，目前尚未发现所有肿瘤都通用的标志物；再者，不是所有肿瘤都会以相同的方式释放 ctDNA，而且 ctDNA 的浓度不仅与肿瘤负荷相关，也与释放至血液的阻力相关（如血脑屏障）。
NGS 大规模应用于临床实践最主要的障碍在于成本太高、检测市场不规范、质量难以保证，医保无覆盖，无相应靶向治疗药物。此外，「共识」指出，NGS 用于临床研究，需平衡患者利益、伦理要求和科学发现之间的关系，以患者利益为至上。需要牢记的是，科学发现服从患者利益是临床试验的基本要求。
