第二节 细胞分离技术
一、从原代组织中分离细胞 将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。
1、胰蛋白酶 (Trypsin)
在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。
将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25％溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。
在4℃孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。
移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。
在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过无菌不锈钢丝网（100～200mm）过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。
2、胶原酶 (Collagenase)
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次。
加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS中）。
在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。
通过离心在HBSS中清洗悬液几次。
再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
3、Dispase
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。加入Dispase（0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）在37℃孵育20分钟到几个小时。
通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase。通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。
二、从原培养容器中分离细胞:以下是从基层迅速分离细胞，且保持细胞完整性的一般步骤。这一步骤并不意味着对于所有细胞系的广泛应用，每一种系统最佳条件和施用浓度应该根据经验加以确定。再次培养时检测细胞的活性。细胞的活率应该超过90％对于无血清培养基，降低胰蛋白酶使用量。
1、移弃使用过的细胞培养基。
2、使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗细胞（看表确定正确的清洗溶液）。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液，通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层，然后去除清洗液。
3、以2～3ml/25cm2的量，加选择的分离液(见表)到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆盖细胞层。在37℃孵育培养瓶，轻轻摇动培养瓶。通常，在5到15分钟内，细胞就会脱落。细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。对难于从培养瓶基层分离的细胞系，可以轻轻敲打，以加速分离过程。
4、当细胞完全分离时，垂直放置培养瓶，让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全培养基，通过移液管在单层细胞表面反复吹打来分散细胞。计数并再次培养细胞。
5、对于无血清培养基，加入大豆胰蛋白酶抑制剂。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制剂到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性。
第三节 细胞的冻存与复苏
为了防止因污染或技术原因使长期培养功亏一篑，考虑到培养细胞因传代而迟早会出现变异，有时因寄赠、交换和购买，培养细胞从一个实验室转运到另一个实验室，最佳的策略是进行低温保存。这对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。现简要介绍深低温保存法(－70℃~－196℃)的特点。细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。
一、细胞的冻存：为避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。
有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下：
包含10％甘油的完全培养基，
包含10％二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基，
50％ 细胞条件培养基和50％含有10％甘油的新鲜培养基，或
50％ 细胞条件培养基和50％含有10％二甲基亚砜的新鲜培养基。
对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是：
50％ 细胞条件无血清培养基和50％包含有7.5％二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基，或
包含有7.5％二甲基亚砜和10％细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。
1、悬浮细胞
计数将要冻存的活细胞。细胞应该处于对数生长期。以大约200～400g离心5分钟沉淀细胞，使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
以1×107到5×107细胞/ml密度，在包含有血清的冷冻培养基中再次悬浮细胞，或者以0.5×107到1×1027在无血清培养基中，再次悬浮细胞。
分装进冻存管，将冻存管置于湿冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。
细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。
2、贴壁细胞
使用分离试剂从基层分离细胞，分离时尽可能温和，使对细胞的损伤减少到最小。
在完全生长培养基中，再次悬浮分离细胞，确定有活力细胞数。
以大约200g离心5分钟沉淀细胞。使用移液管移去上清到最小体积，不要搅乱细胞。
以5×106到1×106细胞/ml密度，在冻存液中悬浮细胞。
分装进冻存管，将冻存管置于湿的冰上或放入4℃冰箱中，5分钟内开始冷冻步骤。
细胞以1℃/分钟进行冷冻，可以通过可编程序的冷冻器进行或者把隔离盒中的冻存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后转移到液氮中贮存。
二、冻存细胞的复苏:冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。
1、直接铺板方法
取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。
直接用完全生长培养基铺板细胞。1ml冻存细胞使用10~20ml完全生长培养基。进行活细胞计数，细胞接种应该至少在3×105活细胞/ml。培养细胞12到24小时，更换新鲜的完全生长培养基，去除冻存剂。
2、离心方法
取出贮存细胞，37℃水浴中快速融化。
把1到2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。
以大约80x g离心2到3分钟。
弃去上清。
在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。
细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。
三、细胞的分化、衰老与死亡
1、细胞的分化:一个成年人全身细胞总数约1012个，可以区分为200多种不同类型的细胞：形态结构，代谢，行为，功能等各不相同。追根溯源，这么多种细胞均来自一个受精卵细胞。所以，通常把发育过程中，细胞后代在形态、结构和功能上发生差异的过程称为细胞分化。细胞分化发生在胚胎阶段，也发生在胎儿出生以后，乃至成人阶段。例如，人体血细胞的产生和分化，这个过程在人的一生中一直持续着。
由旺盛生长不断分裂的细胞，转入分化，通常从细胞周期中G1期开始时一个确定的点G0点“逃逸”出细胞周期。旺盛生长分裂的细胞和各种分化了的细胞，它们的基因表达和代谢活动各不相同。
2、细胞的衰老:体外细胞培养实验证明：
成纤维细胞：来自胎儿传代50次后衰老死亡,来自成人传代20次后衰老死亡(与具体年龄有关);来自小鼠传代14--28次后衰老死亡,来自乌龟传代90--125次后衰老死亡。
细胞衰老过程中会发生一系列的变化，包括：蛋白质合成速度降低，已有蛋白质结构变化，特异蛋白质成份出现；同时，细胞核，线粒体，膜系统、骨架系统等都有结构、功能的改变。
细胞衰老原因，尚无定论，出现过好几种理论与假说，其中得到较广泛认可的是“自由基损伤假说”。
