有细胞增殖,传若干代后停止生长或衰退死亡;
传数代后细胞增殖缓慢,经过一段停滞期后,才又呈旺盛生长状态,形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。
以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求,并需经过对新环境的适应才能生长,因此欲获得好的培养效果,不能局限于一般培养法,必须采用一些特殊的措施。
1、适宜底物:把经过纯化的细胞接种在不同的底物上,如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。
2、生长因子:应用促细胞生长因子,向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物,常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。
为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞(干细胞)的数量,可采用动物体转嫁接种成瘤后,再从动物体内取出进行培养,能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。
3、动物体媒介培养方法:
(1)瘤块接种:取新鲜瘤组织,用Hanks液洗净血污,切成1~3毫米小块,用穿刺针头吸一小瘤块,用酒精棉球擦拭动物腹部后,直接刺入皮下,注入瘤块;
(2)饲养观察,待肿瘤生长达较大体积后,剥取出瘤组织;
(3)进行体外培养。
(4)为防止失败,仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种,有活力的肿瘤细胞数量增多,细胞培养易于成功。
肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞完全相同,但成功率比正常细胞高。
五、体外培养肿瘤细胞生物学检测
一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系(或株)后,不论用于实验研究还是建立细胞系,都需要做一系列的细胞生物学测定,主要的目的在于求得证明:
所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞,而非正常细胞或其它细胞。均具有瘤种特异性。阐明一般生物学性状。测定项目数量无明确规定,根据需要而定,以下为常做的项目和要点。
【形态观察】主要观察细胞的一般形态,如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。
【细胞生长增殖】检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。
【细胞核型分析】检测核型特点,染色体数量、标记染色体的有无、带型等。
【凝集试验】检测凝集力。
【软琼脂培养】检测集落形成能力。
【异体动物接种】向异体动物体内(皮下)接种细胞悬液,观察成瘤能力。
【其它】除上述项目外,根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析,荧光显微镜观察等。
在上述肿瘤细胞生物学检测中,最主要的为:异体动物(以用裸鼠为上)接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抗癌基因等的检测,这些项目将在本书第二篇中介绍。
二、培养方法
肿瘤细胞培养成功关键在于:取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面,肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别,初代培养应用组织块和消化培养法均可。
1、取材:
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要,体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区,取材时尽量避免用退变组织,要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养,如因故不能立即培养,可贮存于4℃中,但不宜栽过24小时。
2、培养基:
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格,一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低,正常细胞培养不加血清不能生长,肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大,是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine)性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子;肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等)。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
3、成纤维细胞的排除:
成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长,致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快,最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法(表2-1)。
表2-1 抑制成纤维细胞生长因素
方法 | 因素 | 组织细胞 |
---|---|---|
选择性附着 | 胰蛋白酶 | 胚胎小肠、心肌、表皮 |
胶原酶 | 乳癌 | |
聚丙烯酰胺 | 各种肿瘤 | |
选择性附着底物 | 聚四氟乙烯(Teflon) | 转化细胞 |
胶原(猪皮) | 表皮细胞 | |
小鼠3T3 | 表皮 | |
汇合饲细胞层 | 人胎小肠 | 正常和恶性乳腺上皮 |
D-缬氨酸(Valine) | 结肠癌 | |
选择性培养基 | MCDB-710 | 肾组织 |
MCDB-153 | 乳腺 | |
Phenobarbitone | 表皮 | |
肝细胞 |
注:上表结果为个别实验室经验,仅供参考
三、成纤维细胞排除法
1、机械刮除法:
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝)、或裹少许脱脂棉制成,装入试管中高压灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。刮除程序为:
(1)标记:镜下观察,用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位;
(2)刮除:弃掉培养液,把无菌胶刮伸入瓶皿中,肉眼或显微镜窥视下,刮除无标记空间;
(3)用Hanks液冲洗一两次,洗除被刮掉的细胞;
(4)注入培养液继续培养,如发现仍有成纤维细胞残留,可重复刮除至完全除掉为止