关于生物发光与荧光及其它技术的比较
34. 荧光检测与生物发光检测的优势与劣势比较如何？ 荧光发光需要激发光，但生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，则需要较高能量的激发光源，也就会产生很强的背景噪音。作为体内报告源，生物发光较之荧光的优点之一为不需要激发光的激发，它是以酶和底物的特异作用而发光，且动物体自身不会发光，这样生物发光就具有极低的背景。虽然荧光信号远远强于生物发光，但极低的自发光水平使得生物发光的信噪比远高于荧光。另外，生物发光信号可以用于精确定量。因为荧光酶基因是插入细胞染色体中稳定表达的，单位细胞的发光数量很稳定。 即便标记细胞在动物体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的相对数量。而对于荧光，光在体内路径较长。信号水平取决于激发光的强度、发光细胞的数量、靶点的深度，光线穿过的组织对其的吸收及散射等因素，使得荧光强度很难定量。 因为这些原因，目前大部分高水平的文章还是应用生物发光的方法来研究活体动物体内成像。 但是，荧光成像有其方便，便宜，直观，标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点，在一些植物分子生物学研究和简单的动物体内研究方面也得到应用。对于不同的研究，可根据两者的特点（表1）以及实验要求，选择合适的方法。
| 优 点 | 缺 点 | |
|---|---|---|
| 生物发光 | 高灵敏度 对环境变化反应迅速 成像速度快，图像清楚 在体内可检测到102 细胞 | 信号较弱，需要灵敏的CCD镜头 需要注入荧光素 仪器精密度要求高 细胞或基因需要标记 |
| 荧光 | 多种蛋白及染料可用于多重标记 标记相对简单 可同时用于FACS分类 未来可能用于人体 | 非特异性荧光限制了灵敏度 体内检测最低约106细胞 需要不同波长的激发光 很难精确体内定量 |
35. 为什么用荧光素酶，而不是用绿色荧光蛋白来检测体内发光? 一方面是荧光素酶的偏红光比绿色荧光蛋白的绿光在体内的穿透性要强近一百倍。另一方面，荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强。这样一来，得到的信噪比很高。而荧光蛋白需要激发光来产生反射光。老鼠的毛皮、肌肤以及一些食物都会产生非特异性荧光，造成很强的非特异性背景光，得到的信噪比很小。虽然荧光蛋白的发光强度很高，大量应用于体外检测；但荧光酶标记的方法更适合于体内检测。荧光酶体内检测的灵敏度要比荧光蛋白在体内的灵敏度至少高三个数量级(1000倍)。
36. 发光的波长与体内的穿透性如何关系？ 荧光素酶发出的光主要是偏红光，与绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光不同。荧光素酶的偏红光比绿色荧光蛋白的绿光在体内的穿透性要强近一百倍。因为光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域，大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。
37. 相对于传统技术，生物发光成像技术的优势在哪些研究领域？ 该技术是一项在某些领域有很大不可替代优势的技术，但是并不是万能的技术。与传统技术相比，肿瘤转移研究，基因治疗，流行病学的发病学研究，干细胞示踪，白血病的相关研究等是该技术非常有优势的领域。在药物开发方面，用该技术进行肿瘤的药效研究，比传统方法更灵敏，还可以通过一系列转基因疾病动物模型，来快速直观的进行相关疾病的发病机理和药物筛选研究。
38. 生物发光成像不能标记的领域？ 小分子药物，多肽等。这些方法现今为止的最好的标记方法还是以放射性标记。
39. 生物发光成像和小动物CT比较有什么特点和优势？ 小动物CT的基本原理是利用X射线成像，通过对所观察对象的密度变化，进行动物内部结构方面的研究。他的优点是分辨率高，不需标记。缺点是特异性差， 在肿瘤很小时无法区分肿瘤细胞和正常细胞，并且对于肿瘤细胞的活跃程度不敏感。如2005年1月JCI的一篇关于乳腺癌骨转移的文章里，详细比较了小动物CT与生物发光成像在肿瘤转移方面的灵敏度。小动物CT要在接种16天以后，成瘤很明显后才能够观察到骨转移的存在。而生物发光成像在接种后当天就可以实时观察到癌细胞的转移和走向。并且，小动物CT需要对动物有较强的X-射线照射， 容易引起突变，对动物的生理有一定影响。
40. 小分子药物的标记用荧光与PET，哪一个更好？ 如果用荧光蛋白，可以标记细胞或病毒。 如果使用合适的荧光小分子， 如Cyt5.5等，可以标记蛋白例如抗体等大分子或者多肽。但是再小的分子如小分子药物等，只能用放射性同位素标记， 用PET或SPECT的方法进行研究。 因为即使荧光基团如Cyt5.5也会影响小分子药物的药理药效和代谢活动。
41. 体内可见光技术和其它体内成像技术(PET, CT, 及MRI)的比较 简单优点：适用于小动物的研究，灵敏度高，特异性好，操作简单，无放射性，价钱便宜。缺点：无法标记小分子药物，暂不适用于人类和临床(正在研究中)，分辨率低，体内精确定位有限。
关于技术应用
42. 可以用荧光素酶基因标记干细胞吗？如何标记？ 可以，标记干细胞有几种方法。一种是标记组成性表达的基因，做成转基因小鼠，干细胞就被标记了，从此小鼠的骨髓取出造血干细胞，移植到另外一只小鼠的骨髓内，可以用该技术示踪造血干细胞在体内的增殖和分化及迁徙到全身的过程。另外一种方法是用慢病毒标记神经干细胞。以上内容都有相关的文献报道。
43. 该技术在抗肿瘤新药研究方面的应用如何？ 在用该技术进行抗肿瘤新药的研究方面，主要是药效学评价。用活体成像的方法比传统技术有更高的灵敏度，当用传统的方法，还不能检测到瘤块时，用该技术已经可以检测到很强的信号。还有由于该技术只是检测活跃的细胞，那些已经凋亡的癌细胞是检测不到的，而用传统的方法，不能区别正常的癌细胞与凋亡的癌细胞，所以该技术可以比传统技术更早的发现药物的疗效，比传统方法更灵敏。目前已经应用该技术进行的抗肿瘤药效研究的有SU11248（乳腺癌新药），Topotecan（已经上市的抗肿瘤） 等。
44. 蛋白质与蛋白质的关系，如何研究？ PNAS(美国科学院院报)上发表的一篇文章介绍，可利用体内可见光成像技术研究活体动物体内蛋白与蛋白的相互作用。具体方法是：将分开时都不单独发光的荧光酶的C端和N端分别连接在两个不同的蛋白质上，若是这两个蛋白质之间有相互作用，荧光酶的C端和N端就会被带到一起，产生发光现象。
45. 可以研究药物对蛋白质相互作用吗？ 可以。在活体条件下应用该技术研究药物对蛋白质相互作用的影响。可以把在体外实验中无法模拟的活体环境对蛋白质相互作用的影响也计算在内（PNAS04）。
46. 可以研究蛋白质核运输吗？ 可以。研究方法类似于研究蛋白质相互作用的方法。在荧光素酶基因的一端接要研究的蛋白质的基因，另一端接肯定在细胞核内表达的蛋白的基因，当核外的蛋白运输到核内时，就会导致荧光素酶N断、C端靠近，恢复发光。
47. 可以用该技术研究基因表达吗？ 可以，研究基因表达可以从影响基因表达的各个不同的层面进行相关的研究，如利用融合蛋白（p27-luc融合蛋白研究其在Cdk细胞分裂周期的表达Nature Medicine 2004），兴趣基因启动子控制的荧光素酶（Catenin在肿瘤转移的信号传导机制Nature 2005）， iRNA方式（HCV-luc的iRNA抑制表达Nature 2002），和转基因动物（NFkB在Hypoxia的表达JCI 2004）等方法。若有兴趣，可以与我们索取相关文章。
48. 细胞凋亡的研究 PNAS(美国科学院院报)上发表的一篇文章介绍，可利用体内可见光成像技术直接观察活体动物体内的细胞凋亡(附上细胞凋亡的文章)。具体方法是：用分子生物学方法在荧光酶的两端连接上抑制其发光的蛋白(如雌激素)，但在其连接处加上CASPASE(细胞凋亡时特异表达的一种酶)的酶切点。细胞发生凋亡时，表达CASPASE，切开抑制荧光酶发光的蛋白，使荧光酶开始发光。详细内容见文章。
49. 该技术只是能示踪细胞的走向，而不能进行相关的机理研究？ 不对。该技术最初的应用是在观察肿瘤细胞、病原微生物或干细胞的走向，分布等，但是目前随着该技术的普及，其应用已经扩展到很多方面，原来只能在分子水平上研究的内容，现在也可以在整体动物水平上进行更接近活体环境状态的研究，如蛋白质相互作用，细胞凋亡，基因表达等等。 基本上把分子生物学在体外的一些研究方法在体内进行实现。由于体内与体外的各种微环境上的差异，造成体外实验结果对活体生物机理研究的局限性，相信在整体水平的研究，必将有广阔的发展空间。
50. 在药物临床前研究中的应用如何？ 利用活体成像技术高灵敏度，观察方便的特点，在抗肿瘤药物临床前研究中，通过给予肿瘤接种的小鼠不同的剂量，并不同的给药时间、不同的给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、给药剂量并给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间。我们搜集了许多药物研究方面的相关文献，请同我们联系， 希望与您共享。
51. 相对于传统技术，在肿瘤学研究中的优势在哪里？ 有更高的灵敏度，可以定量研究，可以方便的观察肿瘤转移与复发的情况，可以避免由于宰杀老鼠而造成的组间差异，可以节省动物的成本。 并且应为这项技术的超灵敏性，微小的肿瘤转移兆（少到100多个细胞）就可以检测到。 比用传统方法可以检测到的灵敏度大大提高。也可应用转基因技术制作自发肿瘤模型从事相关的研究。
52. 如何利用该技术研究药物代谢？ 标记与药物代谢有关的基因，比如CYP3A4等，研究不同的药物对该基因表达的影响，从而可以间接知道相关药物在体内代谢的情况。并且，小分子及多肽药物也可以利用荧光素（如Cyt 5.5等）标记， 观察它们在动物体内的走向，变化及代谢等。
53. 如何进行相关疾病机理的研究？ 可以标记与某种疾病密切相关的基因，做成转基因小鼠，通过特定的药物作用或其他条件下，该基因表达的变化，来推测该疾病的发病机理，药物对该疾病治疗的效果等。我们已经标记好了几十种转基因动物提供给研究人员，也提供相关方面的服务。
54. 在中医学方面的应用前景如何？ 由于该技术在整体动物水平上观察生物学变化，与中医的整体观念有些相似。目前，有很多中药在治疗疾病上有很好的疗效，但是由于其复杂的组分，复杂的作用机理，很难用目前的分子水平的研究解释清楚。如果从宏观的水平，根据所研究内容的不同，应用该技术的一些疾病模型，从基因表达等方面观察某些中药的治疗效果，将是一个不错的方向。台湾的中医学界在这个方面有很深的研究。
55. 在免疫学领域应用如何？ 观察流体细胞在体内的动向和变化使这个技术的一大优势。 可以标记免疫细胞，如T 细胞，NK细胞，观察免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀死。也可以标记干细胞及异体细胞，观察干细胞烟花和器官移植的研究。也有一些关于免疫因子的研究报道等。
56. 在RNA阻断方面的应用如何？可以标记siRNA吗？ 可以用荧光素酶基因标记兴趣基因，利用荧光素酶的iRNA观察其对兴趣基因的表达抑制（Nature 2002）. 也可以标记肿瘤细胞，间接观察阻断RNA对肿瘤细胞的识别和杀伤。
57. 相对传统技术，在抗生素药物筛选方面的优势如何？ 同一批老鼠持续观察，避免个体间差异； 有更高的灵敏度，可以在感染早期就进行活体观察。可以有结构信息，在活体动物整体上观察感染途径。定量，可以比较各个器官的感染程度，更直观。
