过去 10 年里，学者们对激素受体阳性乳腺癌和三阴乳腺癌（BC）异质性的分子特征进行了大量研究，提出了相应的病理学/免疫组化（IHC）亚型，但这种分型并不适用 HER2+（cHER2+）BC。cHER2+ BC 是一种预后不良的疾病，特征是 HER2 蛋白过表达和/ HER2 基因扩增，抗 HER2 抗体曲妥珠单抗治疗有效。
虽然可以根据 HER2 状态来确定 cHER2+ BC 亚型，但 HER2 只是 BC 众多基因改变中很小的一部分，当采用分子分型时，无论 cHER2+状态如何，不同的 BC 分子亚型（luminal A、 luminal B、富含 HER2 的 [HER2e]、 基底样的、 低表达 claudin 的）总是拥有各自独特的生物学功能和临床结果，cHER2+的分型预后作用似乎消失了。
在 cHER2+基础上，特定的分子亚型如何预测曲妥珠单抗治疗是否获益，现在对此几乎一无所知。西班牙的 Castillo 博士在 Oncotarget 杂志上发文，结合其自身研究发现，提出了新的理论框架，即根据分子特征对 cHER2+ BC 重新分类，预测曲妥珠单抗治疗反应。
基底样-HER2+亚型在所有 cHER2+ BCs 中预后最差
混合性 BC 亚型可能对曲妥珠单抗原发耐药，因为它既有 HER2 过表达/扩增，也有基底样分子背景，尚不清楚哪个 IHC 标志（如 CK5、CK5/6、CK14、CK17 和/EGFR）单独或是联合可以明确定义基底样 BC。
Chung 最近报告 97 例 1-3 期 HER2+ BC 患者，至少 37% 表达一种基底标志，根据标志表达情况发现 15% 的 CK5/6+/HER2+ BC、8% 的 CK14+/HER2+ BC 和 34% 的 EGFR+/HER2+ BC。该团队曾报道在 131 例 HER2+肿瘤中，如果只参考 CK5/6 或 CK14 的表达情况，9% 为基底-HER2+表型。
一项大型研究纳入了 713 例激素受体阴性侵袭性 BC，8% 为基底-HER2+病例，表达 HER2 和任一基底标志 CK5/6、CK14 或 EGFR。Castillo 最近报道了 152 例 HER2+原发侵袭性导管 BC，根据是否表达基底标志 CK5/6，16% 的 cHER2+病例为基底-HER2+表型。
Prat 采用分子数据对 BC 分型，共纳入 1700 余例未接受过曲妥珠单抗治疗的患者，cHER2+ BC 中基底样亚型 14.1%，基底样亚型中 cHER2+者约 14.4%，二者很相似。cHER2+肿瘤中 HER2e 和基底样亚型的 HER2 基因和蛋白表达明显高于 luminal 亚型。研究得出一致结论即所有 HER2+亚型中，基底-HER2+患者无病生存和总生存最差，甚至比高度侵袭性的基底样 BC 还要差。
cHER2+ BCs 中基底样表型对曲妥珠单抗治疗反应最差
现已证实基底-HER2+表型是极具侵袭性的 cHER2+ BC，Castillo 博士的研究中纳入 69 例 HER2+患者接受含曲妥珠单抗的辅助/新辅助治疗，基底-HER2+表型是独立预后标志，TTF 非常差，首次揭示基底-HER2+患者不能从曲妥珠单抗联合化疗的治疗中获益。
Chung 最近证实 CK5/6 和 EGFR 表达是 HER2+ BC 曲妥珠单抗治疗预后差的标志。与其它分子亚型相比，基底样亚型对化疗反应较好，但基底-HER2+肿瘤曲妥珠单抗联合辅助性化疗治疗后复发率却更高，这应当看作是 cHER2+肿瘤基底蛋白表达导致曲妥珠单抗耐药。
Chung 未能明确 CK5/6 预测耐药的界值，但 Castillo 博士的研究建立了以 10%CK5/6 阳性作为预测曲妥珠单抗耐药的界值，上述研究都是基于 2007 年 Harrys 的研究结果，该研究证实 HER2+肿瘤过度表达与基底样表型相关基因时（如基底角蛋白），对术前曲妥珠单抗联合长春瑞滨治疗耐药。
基底-HER2+ 混合性亚型累积多种 CSC 相关的曲妥珠单抗耐药机制
大量文献论述了曲妥珠单抗耐药的可能机制，这些耐药机制与耐药癌症干细胞（CSCs）分享了很多相同的标志和信号途径。高度侵袭性基底样 BC 拥有丰富的 CSC 样特征，因此提出在基底-HER2+疾病中，基底标志、增加的 CSC 活性、曲妥珠单抗耐药间可能存在因果联系。
Castillo 博士的研究以及其它研究证实曲妥珠单抗耐药的基底-HER2+细胞累积了大量已知的曲妥珠单抗耐药机制，彼此间互不排斥（图 1），这些耐药机制的关键媒介与 CSCs 密切相关。
图 1 基底-HER2+（Basal-HER2+）BC 累积了大量曲妥珠单抗耐药机制，相互不排斥，与 CSCs 密切相关。
体外研究已证实上述推论，如果要在实践中证实 CSCs 在曲妥珠单抗耐药中的作用，首先应承认曲妥珠单抗有效性至少部分与直接靶向抑制 HER2+肿瘤中的 CSCs 有关。即使在缺乏 HER2 过表达/扩增的情况下 HER2 蛋白看起来仍是 BC 中 CSCs 的关键驱动因素，这可能是辅助性曲妥珠单抗治疗 cHER2 阴性 BC 有效的原因。
因为基底-HER2+肿瘤在曲妥珠单抗和其它抗 HER 治疗（如拉帕替尼）时仍继续生长，如果曲妥珠单抗有效的分子基础与 CSC 靶向依赖相关，那么最直接的结论就是曲妥珠单抗耐药 HER2+ CSCs 只存在于基底-HER2+ BC 中，不存在于其它 HER2+表型中。
这意味着 HER2+ CSCs 并不是一致的，如果考虑到 BC 中 CSC 样细胞还具有可塑性，那就更需要了解哪些 HER2+ CSCs 才是真正一致的群体。下面提出一个 cHER2+肿瘤对曲妥珠单抗治疗反应的预测方案，需要联合 BC 亚型间的分子差异进行评估。
分子亚型、CSCs 状态和 HER2+ BC：再思考 cHER2+肿瘤的预后和预测作用
乳腺 CSCs 看起来有二种不同但又可互逆的状态，即上皮-间充质（EM）样状态，上皮样状态表达醛脱氢酶（ALDH），间充质样状态表达 CD44+CD24-/low 免疫表型，不同的 CSC 群体可以在不同 BC 分子亚型中共存，但比例变化很大。
HER2e 和 luminal B BC 中存在更多表达 ALDH 的 E-CSCs，而基底样和低 claudin BC 中存在更多的 CD44+CD24-/low M-CSCs。E-CSCs 的基因表达状态与 luminal 干细胞一样，而 M-CSCs 的基因表达状态与正常乳腺基底干细胞一致。在不同 BC 分子亚型不同突变基础上，联合遗传学和微环境因素鉴定每个 cHER2+肿瘤的 CSC 表型。
肿瘤的每个分子亚型与 cHER2+组合后，一个极端是 HER2e/cHER2+肿瘤完全缺乏 CD44+CD24-/low M-CSCs，另一个极端是基底/cHER2+和低 claudin/cHER2+肿瘤中富含 CD44+CD24-/low M-CSCs，ALDH 表达的 CSCs 和 CD44+CD24-/low CSCs 的差别能解释混合性 cHER2+亚型的临床表现和曲妥珠单抗有效性的差别。
另一方面 HER2e/cHER2+和 luminal B/cHER2+亚型中富含表达 ALDH 的 E-CSCs，导致 ALDH 和 HER2 过表达 ，这可能是此类肿瘤临床结果差的原因。曲妥珠单抗的有效性与降低 HER2+ BC 中 ALDH 阳性细胞有关，HER2e/cHER2+和 luminal B/cHER2+ BC 是混合性表型，因此从曲妥珠单抗治疗中获益最大（图 2）。
图 2 预测 cHER2+对曲妥珠单抗治疗反应的新理论，需要结合 BC 的分子亚型（CL: 低 Claudin-low；HER2E: 富含 HER2 的；MET: 间充质-上皮转化；EMT：上皮-间充质转化）。
如果 HER2e/cHER2+和 luminalB/cHER2+ BC 亚型以表达 ALDH 的 E-CSCs 为主，那么在 luminal A/cHER2+亚型中表达 ALDH 的 E-CSCs 就应该很少，这个模型可以解释为什么小部分 cHER2+ BC 患者即便不采用治疗预后也很好。
另一方面富含 CD44+CD24-/low M-CSCs 与基底/cHER2+表型高度侵袭性的临床过程相关，因为 CD44+CD24-/low 细胞能促进间充质相关的 BC 进展，同时因其间充质特征导致对曲妥珠单抗高度耐药，基底/cHER2+和低 claudin/cHER2+ BC 是曲妥珠单抗治疗获益最少的表型。
上皮/间充质 CSC 细胞状态互逆与曲妥珠单抗耐药：预测 cHER2+肿瘤的临床行为
Castillo 博士的理论是 CSC 影响曲妥珠单抗对 cHER2+肿瘤的有效性，但前提是乳腺 CSCs 具有可塑性，允许上皮样（ALDH+）和间充质样（CD44+CD24-/low）状态相互转换。这种互相转换赋予了 cHER2+肿瘤侵袭、播散、转移位点处生长的能力，并最终决定了每个混合性 cHER2+亚型的预后。
也就是说 CSCs 从曲妥珠单抗敏感的上皮样状态可以转化为曲妥珠单抗耐药的间充质样状态，这样 cHER2+肿瘤对曲妥珠单抗的治疗反应具有可塑性，并最终决定了每个 cHER2+亚型预测治疗反应的价值。
需要指出 CSCs 二种状态转化的可塑性程度在不同 cHER2+分子亚型中并不一致：luminal 起源的 cHER2+ BC 因为缺乏上皮样状态而难治，但还能治；而基底/cHER2+和低 claudin/cHER2+ BC 则因天生具有间充质样状态而非常难治。这个模型很容易与现有曲妥珠单抗耐药机制兼容，即耐药由上皮-间充质（EMT）转化现象驱动。
JIMT-1 是首个 HER2+原发曲妥单抗耐药的商用细胞株，富含 CD44+CD24-/low 状态细胞。而且曲妥珠单抗耐药的基底/HER2+ JIMT-1 细胞表达 CD44+CD24-/low M-CSC 样表面标志会随时间变化。低代细胞包含≈10% CD44+CD24-/low 免疫表型细胞，而多代细胞则≈80% CD44+CD24-/low 细胞，再现了富含 CD44+CD24-/low 亚型的特征， HER2 阴性低 claudin BC 亚型具有上述特征。
HER2+细胞发生 EMT 后出现 luminal 表型向低 claudin 表型转化，发生曲妥珠单抗耐药。缺乏上皮标志（如雌激素受体和 E-cadherin）的 HER2+细胞获得曲妥珠单抗耐药 EMT 表型的能力更高，命中注定会转化为间充质状态。高水平表达 luminal 标志的 HER2+细胞将始终保持对曲妥珠单抗敏感的上皮样表型。
上皮样和间充质样 CSC 在各个 cHER2+BC 分子亚型中是连续变化的，其中 EMT 现象是关键机制，当它活化时驱动 HER2 靶向治疗原发和继发耐药。原发 EMT 特征似乎是决定基底/cHER2+ BC 原发曲妥珠单抗耐药的主要原因，获得性 EMT 特征导致 HER2e 和 luminal（A 和 B）/cHER2+ BC 曲妥珠单抗继发耐药，二者共同点是明显降低 HER2 表达。
Castillo 博士的研究显示基底/HER2+细胞中富集 CD44+/CD24-/low CSC 间充质表型时 HER2 表达减少。Lesniak 的研究显示通过 EMT，曲妥珠单抗敏感的 luminal/HER2+细胞自然转换为曲妥珠单抗耐药的 CD44+/CD24-/low 表型时，伴随有 HER2 明显下降。当研究原发和转移肿瘤 HER2 表达不一致性和曲妥珠单抗新辅助治疗的后续治疗时，这些结果对临床影响巨大。
很明显 cHER2+的转移性疾病转化为 HER2 阴性时，总的预后更差，而 cHER2+者曲妥珠单抗新辅助治疗后残留疾病不再过表达 HER2，则无复发生存（RFS）更差。如果 HER2 变化只是反应肿瘤内 HER2 表达的异质性，会得出曲妥珠单抗对完全病理缓解肿瘤和转化为 HER2 阴性肿瘤作用相同。而事实是 cHER2+持续表达 HER2 时 RFS 更佳，说明 HER2 阴性导致残留疾病侵袭性增强。
基底/cHER2+肿瘤很少基底角蛋白全部表达，常常是部分阳性（基底-luminal），呈现出棋盘样的肿瘤内异质性。当大量克隆或细胞簇具有高比例基底/间充质表型且 HER2 表达下降的 CSCs 时，可能就会出现基底/cHER2+肿瘤对曲妥珠单抗耐药，并解释了对不同 HER2 表达状态的影响。
HER2e/cHER2+肿瘤曲妥珠单抗耐药的原因是因为出现了 EMT 现象，导致 CD44+/CD24-/low/低 HER2 表型的间充质克隆或细胞簇增加，而曲妥珠单抗治疗的选择压力同样导致曲妥珠单抗耐药的间充质 CSCs 出现以及肿瘤 HER2 状态的转化。
图 3 可塑性程度决定了 cHER2+ BC 在上皮和间充质 CSC 间转化的能力，在不同混合性表型中存在不同，反应了对曲妥珠单抗治疗反应的差别（PRIMARY RESISTANCE: 原发性耐药；SENSITIVITY: 敏感性；ACQUIRED RESISTANCE: 获得性耐药）。
CSC 类型的可塑性导致曲妥珠单抗治疗有效性的挑战。EMT 表型转化导致 M-CSCs 增加，通过降低增殖、避免化疗药物毒性损害来增强 cHER2+亚型的局部复发能力。通过提高对曲妥珠单抗和化疗耐药的低增殖 M-CSCs 比例，某些分子亚型 cHER2+肿瘤进入循环的能力增强，可在远处形成微转移。
治疗停止后，遗传学多样性、信号途径表观遗传学活性以及肿瘤微环境都会通过 E-CSCs 作用，影响 M-CSCs 转化为增殖状态的可塑性，这样随着时间进展可导致局部和远处肿瘤复发（BOX1）。
目前有临床研究试图证明 cHER2+ BC 中，HER2 阴性 M-CSCs 影响曲妥珠单抗有效性和患者生存主要与基底角蛋白和/转化性 EMT 标志的瘤内异质性有关。体外数据证实 CD44+/CD24-/low 间充质 CSC 状态可塑性可以解释基底/cHER2+ BC 新发生的曲妥珠单抗耐药。
Castillo 博士在研究中通过促进 CD44+/CD24-/low M-CSC 样状态转化为 CD24+E-CSC 样的 CSC 状态，使得曲妥珠单抗耐药的基底/HER2+ JIMT-1 细胞转化为曲妥珠单抗敏感的细胞。
SLUG 是乳腺和乳腺癌发育过程中非常关键的上皮细胞调节因子，去除 SLUG 足以大大降低曲妥珠单抗耐药 CD44+/CD24-/low 免疫表型细胞，而且通过增加曲妥珠单抗敏感的表达 ALDH 的细胞数量使得基底-HER2 阳性细胞群对曲妥珠单抗治疗敏感。
二甲双胍诱导的优势杀伤 CD44+/CD24-/low 细胞也是一样的道理，即克服基底/HER2+肿瘤对曲妥珠单抗的原发耐药，从药理学角度支持概念：相对富集 CD44+/CD24-/low M-CSCs 对曲妥珠单抗有效性起决定作用。已发现多种可致 HER2+肿瘤间充质表型逆转的分子机制，足以克服 cHER2+ BC 的曲妥珠单抗耐药和侵袭转移。
CSC 影响曲妥珠单抗有效性和 cHER2+ BC 重新分类：事关治疗的必然结果
不可否认虽然治疗不断改善，但仍有许多 cHER2+ BC 患者因为疾病进展死亡，因此改善辅助/新辅助治疗的成功率非常关键。不幸的是没有明确的生物学标志能可靠的预测曲妥珠单抗是否原发耐药。虽然新药正在研究，预期与含曲妥珠单抗的治疗联合可以改善早期患者的临床结果，但此时临床医师仍没有明确的指南用于解决日常工作中遇到的情况。
无论 cHER2+状态如何，不同的 BC 亚型各具独特的分子特征和生物学行为，需要前瞻性研究验证 cHER2+ BC 中每种分子亚型是否能预测曲妥珠单抗治疗反应。在这种理论指导下，侵袭性基底样 BC 亚型导致的不仅是众所周知的更差的临床结果，同时也能预测对曲妥珠单抗治疗反应最差。
与现在的临床模型相反（cHER2+和 cHER2-），Castillo 博士提出根据 CSC 相关标志对 cHER2+肿瘤重新分类，不但可以间接获取 CSC 影响曲妥珠单抗耐药的信息，还可以更好的明确 BC 中 cHER2+的预测价值（BOX1）。
cHER2 阴性 BC 的不同亚型可以解释某些矛盾现象，如 HER2e/cHER2-和 luminal/HER2-肿瘤中曲妥珠单抗治疗有效，这是因为肿瘤累积了 HER2（非基因扩增所致）依赖的 ALDH 过表达的 E-CSCs；也能解释曲妥珠单抗在基底/cHER2-肿瘤中为什么无效，因为肿瘤累积了非 HER2 依赖的 CD44+/CD24-/low M-CSCs。
如果细胞 ALDH 强阳性则具有典型 E-CSCs 特征，表现为更具侵袭性表型，这就需要评估 cHER2+和 cHER2- BC 中，干细胞生物标志 ALDH 达到某个界值时是否影响曲妥珠单抗有效性。但需要强调在混合性分子/临床分类实施前，至少有二个关键问题需要解决，这样才能帮助医师决定 HER2+肿瘤的治疗策略。
首先曲妥珠单抗敏感上皮样 CSC 和曲妥珠单抗耐药间充质样 CSC 间的可塑性转化能否解释肿瘤转移时曲妥珠单抗的有效性。虽然 Giordano 报告 HER2+转移 BC 循环中有肿瘤细胞（CTCs）处于 EMT，且富于 CSC 特征，但仍需要明确在接受曲妥珠单抗治疗后的 HER2+转移性 BC 中，EMT-CTCs 和 CSCs 是否同样拥有预后或预测作用。
β1 整联蛋白是基底上皮细胞的结构成分，可作为 CSC 标志，含曲妥珠单抗治疗后，其过度表达是 HER2+转移性 BC 肿瘤进展的独立不良预后因素。对曲妥珠单抗原发耐药的基底/HER2+ BC 中，结构性的过度表达β1 整联蛋白；当曲妥珠单抗敏感 HER2+luminal 细胞向不敏感的 HER2-低 claudin 表型转化时，高度 N-糖基化的β1 整联蛋白变体的表达活化。
Castillo 博士的工作框架预测原发基底/cHER2+或是低 claudin/cHER2+表型可能在转移性疾病中保持不变，而原发 luminal/cHER2+表型发生转移进化时可能出现更大程度的表型转化。
第二明确潜在的临床可用的 cHER2+ BC 分组以改善预后和治疗计划，特别是含曲妥珠单抗治疗不获益的基底/cHER2+和低 claudin/cHER2+ BC 中，应划分亚型，利于患者接受其它治疗，消灭对曲妥珠单抗不敏感的 CSC 间充质状态的肿瘤细胞群。
METTEN 研究是一项 II 期随机开放式多中心试验，纳入诊断为 HER2 阳性的原发 BC 患者，接受新辅助化疗+曲妥珠单抗±二甲双胍治疗，评估二甲双胍抑制曲妥珠单抗耐药 CSCs 自我更新和增殖的能力。
新的抗体-药物加合物 T-DM1，包含了化疗药物 DM1 和曲妥珠单抗，显示了不同的靶向曲妥珠单抗耐药间充质 CSCs 的作用。CD44+/CD24-/low 细胞具有高度内吞活性，使其对 T-DM1 非常敏感。采用 T-DM1 治疗不仅消灭了 CD44+/CD24-/low 细胞，而且还能阻止已分化的肿瘤细胞形成 EMT 诱导的 CSC 样特征。
T-DM1 这一非预期的靶向 CSC 间充质状态的作用可以解释其有效性的原因，因为在动物模型中可以看到曲妥珠单抗耐药的异种移植基底/HER2+ BC 细胞对这种抗体-药物加合物敏感，该药已获批上市。
因为 CD44+CD24-/low 间充质样 CSCs 拥有特异的高水平内吞活性，通过抗体-药物加合物的作用，不相关的 HER2 开启一种类似「特洛伊木马」的方法，允许靶向 CSC 的细胞毒药物快速分发至曲妥珠单抗耐药的基底/cHER2+ BC。IHC 法将 cHER2+ BC 分为基底样/cHER2+和非基底/cHER2+亚型，能提供更好的预后和预测信息。
T-DM1 已获批治疗难治性 HER2+转移性或是局部进展期 BC，可能会改善曲妥珠单抗耐药基底/cHER2+ BC 患者的临床结果，依据基底和 CSC 相关标志的 cHER2 肿瘤分类毫无疑问使 cHER2+ BC 患者获得更好的治疗，而且新分类能提供由 CSC 决定的曲妥珠单抗治疗敏感性的信息，更好的预测 cHER2+ BC 的治疗效果。
BOX 1. cHER2+ BC 中 CSC 影响肿瘤异质性和曲妥珠单抗耐药
BC 治疗的最大挑战是出现肿瘤内异质性，对各种癌症治疗都有不良影响，包括生物制剂如抗 HER2 抗体曲妥珠单抗。虽然影响肿瘤内细胞功能变化的机制仍不清楚，但有大量证据表明遗传多样性、表观遗传学和肿瘤微环境将最终决定分子程序功能，掌控维持不同分子亚型 BC 中的 CSCs。
Castillo 博士的理论认为以 CSC 为基础的 cHER2+ BC 原发性曲妥珠单抗耐药中，遗传学和非遗传学机制对每种分子亚型的 cHER2+ BC（如 luminal A/cHER2+、luminal B/cHER2+、HER2e/cHER2+、基底/cHER2+和低 claudin/cHER2+）的异质性形成都有帮助。
cHER2+ BC 中 CSC 有关的肿瘤异质性发生机制
1. cHER2+ BC 的细胞起源和突变情况
cHER2+ BC 的每个分子亚型都有不同的细胞起源（如乳腺干细胞、双能前体细胞、luminal 前体细胞、后期 luminal 前体细胞以及进一步分化的 luminal 细胞），这代表 cHER2+肿瘤的发育阻滞期处于不同的分化阶段，换言之某种类型的正常乳腺细胞在某个特殊阶段发生了恶性转化。
除了不同的细胞起源，cHER2+ BC 的不同分子亚型与不同的突变状态相关，除了存在 HER2 过度表达/扩增外，每种分子亚型的 cHER2+ BC 都有其独特的突变状态。例如 luminal A/cHER2+ BC 最常见的遗传学改变是 PI3K 信号途径活化突变，而基底 cHER2+和低 claudin/cHER2+ BC 几乎总是存在 TP53 突变和 PTEN 的基因变化。
2. cHER2+ BC 中曲妥珠单抗敏感性和耐药 CSC 类型的变化
cHER2+不同亚型的不同突变状态是遗传学异质性之一，cHER2+ BC 的每种亚型中都有一类细胞通过表观遗传学异质性，负责肿瘤的维持与进展，如 CSCs。遗传学多样性驱动不同分子亚型，二种不同的 CSCs 存在于每种 cHER2+ BC 亚型中：更具增殖活性的表达 ALDH 的上皮样 CSC 和静止的更具侵袭性的表达 CD44+CD24-/low 免疫表型的间充质样 CSC。
这种矛盾共存现象说明存在共同的调节途径指导二种 CSCs 自我更新和分化，与 BC 的分子亚型无关。cHER2+ BC 的各个分子亚型中曲妥珠单抗敏感的上皮 CSCs（E-CSCs）和曲妥珠单抗耐药的间充质 CSCs（(M-CSCs）数量不同。
低 claudin/cHER2+和基底/cHER2+亚型包含更多曲妥珠单抗耐药的 CD44+CD24-/lowM-CSCs，HER2e/cHER2+亚型包含更多曲妥珠单抗敏感的 ALDH 阳性的 E-CSCs，luminal B/cHER2 亚型较 HER2e/cHER2+亚型、基底/cHER2+亚型、低 claudin/cHER2+亚型包含更少的 CSCs，而 luminal A/cHER2 亚型中表达 CSC 标志的细胞比例最低。
3. E-和 M-CSC 状态的可塑性和获得性曲妥珠单抗耐药的 M-CSC 样状态
E-和 M-CSC 的双向转化由可塑性完成，EMT/MET 相关表观遗传学改变最可能由肿瘤微环境、转录调节或一些联合作用信号来调节。E-CSCs 状态产生上皮型肿瘤细胞，最常见于 cHER2+各亚型，M-CSCs 状态产生间充质型肿瘤细胞，多数 cHER2+亚型中少见（如 luminal A/cHER2+、luminal B/cHER2+ 和 HER2e/cHER2+），但在基底/cHER2+和低 claudin/cHER2+亚型中常见。
如果肿瘤进展就会出现更多干细胞样或是间充质表型细胞，当上皮型或间充质型细胞前体分泌信号正向调节其亲代 E-和 M-CSCs 自我更新转换时，可导致本应以上皮型细胞为主的 cHER2+肿瘤出现混合性细胞群。
luminal 起源的 cHER2+亚型中的非干细胞性上皮型肿瘤细胞通过 EMT 表型转换，导致曲妥珠单抗耐药的 M-CSCs 增加，这种情况多发生在分化较差的乳腺干细胞起源的低 claudin/cHER2+亚型。
有证据显示分化较好的肿瘤细胞可通过重新编程样的去分化现象获得 CSC 特征，大量肿瘤细胞通过去分化转化为 CSC 样状态的可能性和程度与 CSC 的传代次数负相。
上述耐药机制都可在曲妥珠单抗治疗的 cHER2+ BC 的 CSCs 中出现，负责细胞可塑性的表观遗传学屏障的功能下降在不同 cHER2+分子亚型中也存在变化，这就决定了不仅 E-和 M-状态的 CSCs 比例会发生变化，而且通过 EMT 或是去分化现象产生 CSC 状态的倾向也会发生变化。
4. cHER2+ BC 中亚型依赖的 CSCs 可塑性
去分化和重编程与癌细胞可塑性高度相关，随着时间进展在不同分子亚型的 cHER2+ BC 中产生异质性，不同程度降低 cHER2+ BC 各亚型的曲妥珠单抗有效性。换言之上述机制有助于 cHER2+肿瘤中出现新克隆，这些克隆具有不同的可塑性、自我更新的 CSC 样特征，这种动态变化受限于其表观遗传学程序和每个 BC 亚型特异性的基因特征。
5. 表观遗传学机制
染色质状态转化可能对 HER2+ BC 细胞可塑性非常关键，因为共价染色质在发育基因的启动子区域同时负责活化与抑制作用，使基因处于平衡状态，如果由微环境中的信号活化，会使非 CSC 和 CSC 样间充质细胞形成明确的上皮特征，或是非 CSC 和 CSC 样上皮细胞增加间充质特征。
癌症发展过程中染色质模式改变是细胞异质性进化的一个原因，乳腺上皮分化细胞起源的 luminal/cHER2+ BC 的发展需要更长时间，需要更多染色质从共价状态转化为稳定的启动子 DNA 高度甲基化。而原始或是分化较差的乳腺上皮起源的低 claudin/cHER2+ BC 或是基底/cHER2+ BC，若细胞表型依赖可塑性较强的染色质状态时，则进展可能非常快。
4 种理论描述了 CSC 驱动的曲妥珠单抗原发耐药：(1) 特异基因启动子的共价调节，使具有可塑性的细胞迅速去分化成为干细胞样细胞，使基底/HER2+细胞较 luminal/HER2+细胞更易对相同的刺激产生不同的反应。
(2) 至少基底/cHER2+肿瘤中一些非干细胞样的上皮细胞会快速转化为 M-CSC 样的去分化状态，当微环境中存在诱导 EMT 的异质性信号时，能更迅速的转化为曲妥珠单抗耐药的 M-CSC 样状态，远快捷于 luminal/cHER2+肿瘤。
（3）获得更加稳定的 M-CSC 表型显然要依赖持续的 EMT 形成信号，如果缺乏信号，M-CSCs 可能会自然逆转回上皮样表型，除非存在其它的表观遗传学改变。
(4) 基底/cHER2+和 luminal/cHER2+肿瘤含有不同数量的 CD44+干细胞，干细胞的上皮特异性基因具有共价染色质结构，所以曲妥珠单抗停用后，干细胞可迅速去分化转化为 CD24+增殖性的上皮细胞状态。
通过活化自分泌信号环 M-CSCs 能稳定维持其间充质状态不变，脱离对旁分泌诱导 EMT 信号的依赖，这种情况在低 claudin/cHER2+亚型中可自然发生， 通过 DNA 过度甲基化使关键上皮基因沉默，从而保持稳定的间充质状态，即便多次分裂后仍可遗传。
可塑性较差的 DNA 过甲基化状态和高度可塑的平衡状态染色质，在 cHER2+各亚型间共存，在个体肿瘤中也会以不同程度共存，这使得 cHER2+ BC 肿瘤内的异质性表观遗传学改变更加复杂。
6. 遗传学机制
除了表观遗传学多样性可以诱导曲妥珠单抗耐药外，单独的遗传学耐药机制也可以影响肿瘤细胞，如果遗传学突变导致曲妥珠单抗耐药的 M-CSC 样状态增加，就会增加 cHER2+ BC 中 CSC 驱动的异质性。cHER2+肿瘤中包含不同的亚克隆，亚克隆除了携带基础突变外还可能携带其它获得性突变，后者导致出现曲妥珠单抗耐药，耐药克隆不断生长成为癌细胞群的主导成分。
例如单细胞原位分析能显示 HER2 基因扩增的频度和结构，同时还能显示关键伴随驱动突变如 PIK3CA 在化疗前后的明显变化。显然化疗能显著影响 HER2+肿瘤遗传学的多样性，主要通过 PIK3CA1 突变细胞的选择来实现，这类细胞在治疗前所占比例很小。
PIK3CA 活化突变通常与 HER2 靶向药物耐药相关，它能促使细胞去分化成为多能干细胞样状态并促进细胞间转化，从而诱导乳腺肿瘤异质性，这种选择依赖化疗或是微环境压力，可能会大大加速肿瘤复发和转移，因为它改变了初始 cHER2+ BC 的表型并产生对抗 HER2 治疗耐药的 M-CSC 样状态。
CSCs 及其后代细胞具有共同的突变，luminal 向基底亚型转化中肿瘤内细胞异质性明显增加，这解释了遗传学和表观遗传学异质性在 CSC 水平共同影响肿瘤的进展。
总的来说，以遗传学和 CSC 为基础的 BC 阶段性模型，在描述肿瘤异质性时常常互相排斥，但如果将 CSC 状态作为中轴生物学特征或是表观遗传学与不同的突变状态综合考虑时，则不再互相排斥。
具有可塑性的表观遗传学平衡染色质状态以及肿瘤内细胞异质性对亚型的依赖程度，都可以转换为新的基因变化怎样产生新的 CSCs 和不同分化的子代细胞，进而导致细胞异质性，这种情况发生于 cHER2+ BC 各亚型肿瘤的自然发展史中。
也就是说个体肿瘤中平衡的表观遗传学状态可能会产生更加多样性的基因表达模式，导致曲妥珠单抗选择下快速进展，驱动多步骤表观遗传学固定的基因表达模式。
cHER2+ BC 中 CSCs 相关的肿瘤内异质性对治疗的影响
曲妥珠单抗是目前唯一能同时靶向上皮型肿瘤细胞和上皮型 CSCs 的抗体，这使得分层治疗非常混乱。如果能杀死 HER2+肿瘤上皮细胞和 HER2+的 E-CSC，则含曲妥珠单抗的治疗获益增加，如果肿瘤富含曲妥珠单抗耐药的非 CSC 间充质肿瘤细胞和 M-CSCs 的 cHER2+亚型，或是初始表型改变倾向增加的肿瘤，那么曲妥珠单抗治疗反应会很差。
