临床综述:免疫反应对结直肠癌发生发展的双重作用

作者:rio2016    2014-10-11
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越来越多的临床证据表明,增强抗肿瘤免疫在肿瘤治疗中发挥了重要作用。结直肠癌(CRC)是肿瘤-宿主免疫关系研究最透彻的肿瘤之一。尽管已经弄清哪些免疫细胞参与了肿瘤-宿主免疫反应,以及这些细胞在结直肠癌发展中具有何种预后价值,然而至今尚无一项基于增强宿主免疫力的肿瘤治疗策略获得临床批准。

此外,免疫反应增强是结肠炎相关结直肠癌(colitis-associated CRC,CAC)发展过程中一个公认的危险因素,这在极大程度上限制了上述肿瘤治疗策略的开展。本文旨在探讨有哪些免疫细胞和细胞因子参与了抗结直肠癌的宿主免疫反应,及分析宿主免疫系统是如何调控促肿瘤效应和抗肿瘤效应的。

核心提示

免疫反应参与了结直肠癌发生发展的所有阶段。最新证据表明,先天性免疫途径在维护结直肠上皮稳态中发挥了基础性作用,此外它还赋予了机体抗肿瘤保护作用。不过,先天性免疫反应是慢性结肠炎发生的病理学基础,而慢性结肠炎又是结直肠癌公认的危险因素。

一旦肿瘤触发机体的免疫反应,大量免疫细胞会有参与到肿瘤发展中,有抑制肿瘤生长的免疫细胞(CD45RO+CD8+T细胞),也有促进肿瘤生长和转移的免疫细胞(T调节细胞)。因此,在设计一种基于免疫反应的结直肠癌治疗和预防策略时,我们需要先了解各种免疫细胞和细胞因子的具体调控方式。

前言

结直肠癌是世界范围内肿瘤患者的第三大死因。据统计,2014年美国新发结直肠癌患者为190,000人,结直肠癌致死患者为35,000人。众所周知,结直肠癌发生的最初事件是肠隐窝基底的干细胞突变,而后肠道上皮增生以发育不良、腺瘤息肉病变的形式进行恶性转化。

在结直肠癌研究领域存在一个有趣的争论,免疫反应/炎症反应在结直肠癌发生过程中具有双重作用,这是利还是弊?先前已有大量临床前和临床研究发现,粘膜免疫反应/炎症细胞可以促进或抑制结直肠癌(CRC)细胞的生长。

根据与炎症反应关系的差异,可以将结直肠癌分为两类:(1)散发性结直肠癌(Sporadic CRC,SCRC),一种源于内在遗传不稳定性的肿瘤,炎症反应滞后于肿瘤发生;(2)炎症诱导性结直肠癌(结肠炎相关结直肠癌,CAC),一种由慢性炎症性肠道疾病(IBD)诱发的肿瘤。

人类最常见的两种慢性炎症性肠道疾病是溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和Chron’s疾病(CD),它们均与结直肠癌发生相关。Chron’s疾病与结直肠癌的相关性不是很强,而溃疡性结肠炎已经成为用于结直肠癌诊断的明确风险因素。慢性炎症反应的程度、持续时间与癌症的发病风险相关。

然而,目前尚不清楚为何仅有少量的慢性炎症性肠道疾病患者罹患结直肠癌。与其他类型肿瘤一样,散发性结直肠癌和结肠炎相关结直肠癌均会出现免疫/炎症浸润,也就是所谓的“肿瘤诱发性炎症反应/炎症反应”。研究发现,参与肿瘤免疫反应的细胞或因子各异,它们对肿瘤患者结果的影响也不同。

例如,CD4(+)T-辅助1(T(H)1)细胞、CD8(+)细胞毒性T细胞和髓样细胞是结直肠癌患者预后良好的主要指标,而T调节细胞(Tregs)和T辅助白介素(IL)-17产生(T(H)17)细胞可以促进结直肠癌的发生,并与I/Ⅱ期结直肠癌患者的无病生存率剧降相关。

在上皮屏障的保护下,免疫细胞无法接触上皮性肿瘤,因此最终上皮性肿瘤会着生大量的微生物菌落。微生物的产物侵入肿瘤组织可能会造成上皮屏障退化,机体对这些微生物和上皮屏障退化的免疫反应在很大程度上加重了结直肠癌组织中炎症反应/免疫反应的程度和特征。

可以想象,炎症/免疫浸润和相关因子的类型、程度和持续时间在结直肠癌发生和发展中发挥了关键作用。本文综述了关于炎症反应/免疫反应和结直肠癌关系的最新研究,并总结了肿瘤浸润性先天性免疫细胞和适应性免疫细胞在促进、维持或抑制结直肠癌生长中的作用。

免疫反应和结直肠癌发生

细菌诱发性免疫与结直肠癌发生风险

“致癌”细菌的肠道感染可能与结直肠癌发生相关。大量研究发现,感染过程的促肿瘤作用可能与特定微生物所触发的炎症反应相关。结直肠癌患者的肠道中存在多种具有生长优势的机会性细菌(opportunistic bacteria),尤其是机会性致病菌-链球菌(Streptococcus),有人将其作为一种肿瘤诱因。

1950年,有人发现链球菌感染和胃肠道肿瘤间存在潜在的相关性。Boleij团队的研究结果显示,结直肠癌与牛链球菌(Streptococcus Bovis)感染相关的可能性为65%。然而,并不是所有的链球菌都有致癌能力,目前仅发现牛链球菌和解没食子酸链球菌(Streptoccucus gallolyticus gallolyticus)两个亚种与结直肠癌显著相关。

解没食子酸链球菌诱发性致病模型的研究结果表明,肠道上皮微环境中有利的代谢和营养改变是诱发癌前腺瘤病变的主要原因(特别是高浓度的乳酸和碳水化合物)。解没食子酸链球菌感染的肠道腺瘤一旦出现,细菌就会诱发一种COX-2(高表达)通路相关的炎症反应。

COX-2可以促进上皮细胞增殖,抑制上皮细胞凋亡,以及触发血管新生。接近80%的结肠癌组织高水平表达COX-2。此外,有证据表明抗COX-2药物(例如,阿司匹林等非甾体类抗炎药)可以抑制结直肠癌发生发展。人体样本(粪便或外周血清学检测)链球菌感染的微生物检测已经成为早期结直肠癌诊断的有效手段。

然而,基于链球菌菌落的早期结直肠癌检测仅有很小的诊断价值。特别是,体内存在解没食子酸链球菌的结直肠癌患者仅占50%。此外,当前的血清学检测仅能识别在解没食子酸链球菌菌毛上表达的抗原,而这些抗原是具有广泛的序列异质性。解没食子酸链球菌多抗原血清学检测结果的敏感性仅为16%-34%。

此外,多项研究也分析了炎症性肠道疾病患者体内细菌感染与结直肠癌发展间的关系。可变梭杆菌(Fusobacterium varium)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肝螺杆菌(Helicobacter Hepaticus)和梭状梭菌(Clostridium Clostridioforme)等多种共生菌通常隔离于炎症性肠道疾病粘膜。

这些细菌可以黏附在结肠上皮细胞表面,侵入它们的细胞质,从而促进肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-8和IL-6的释放。这些细胞因子均可能诱发炎症性肠道疾病和结直肠癌。最近动物模型试验研究显示,大肠杆菌和肝螺杆菌可以诱发慢性结肠炎和肿瘤,还可以促进具有遗传毒性能力致病性病毒、真菌和寄生虫的发展。

上述结果表明,特定微生物是促进结直肠癌发生的一种发病诱因,它们的主要作用是加剧炎症反应(炎症反应是肿瘤发展的公认诱因),而不是对宿主发动直接的诱变攻击。

先天性免疫和结直肠癌发展

先天性免疫是肠道上皮抵抗微生物攻击的第一道防线。机体起初通过细胞表面和细胞内受体识别微生物,这些受体可以识别微生物相关的保守型分子模式,也就是所谓的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)。

目前已经发现多种类型的模式识别受体,其中有两种受体在肠道先天性免疫中发挥重要作用,细胞质NOD(核苷酸结合和寡聚化结构域)和NOD样受体(NLRs)和膜结合Toll样受体(TLRs)。共生菌和致病细菌可以过度激活机体的模式识别受体,这是炎症性肠道疾病和结肠炎相关结直肠癌中所出现炎症反应的发病基础。

结肠炎相关结直肠癌约占已确诊结直肠癌患者人数的2%,而散发性结直肠癌约占95%。通常认为散发性结直肠癌的发病过程不同于结肠炎相关结直肠癌,主要在于多步基因丢失的差异,例如最初的APC突变和beta-catenin激活,以及随后的K-Ras、PIK3CA和TP53突变。

有三项动物实验已经对模式识别受体在结肠炎相关结直肠癌发展中的作用进行了探讨。这些动物实验通过使用葡聚糖硫酸酯钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱发小鼠结肠炎以模拟人类的炎症性肠道疾病,此外还使用葡聚糖硫酸酯钠和氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)诱发小鼠结肠炎相关结直肠癌。

这些研究的结果使得大家对“先天性免疫促进肿瘤发生”产生了质疑,因为先天性免疫不仅发生在炎症细胞(巨噬细胞、树突细胞和中性粒细胞),还发生在上皮细胞。在上皮组织中,先天性免疫可以维持细胞稳态、抑制结肠炎和结肠炎相关结直肠癌发生。

这些研究主要针对于:(1)跨膜受体TLR-4(识别革兰氏阴性菌的脂多糖,LPS)、TLR-2(识别革兰氏阳性菌脂磷壁酸,LTA)及其相关的胞内信号传感器MyD88(髓样分化因子88);(2)NOD1和NOD2受体及其中介受体反应蛋白2(RIP2);(3)NLR-P3及其终端分子效应器caspase 1和caspase12。

TLR-2/TLR-4/MYD88通路:2004年Rakoff-Nahoum团队研究了DSS诱导性结肠炎小鼠对TLR4、TLR2和MyD88多基因敲除以及对RIP2单基因敲除的敏感性。他们发现肠黏膜上皮细胞(IECs)表面的TLRs一般由共生微生物激活,这种共生关系是上皮细胞生理功能所必需的。

他们认为TLRs通路缺失可以弱化炎症反应,从而减轻机体的结肠炎。与野生型(WT)小鼠相比,MyD88-/-小鼠在DSS处理后会出现严重结肠炎、死亡率剧增,这表明MyD88依赖性通路具有一定的保护作用。MyD88是多个信号级联系统的重要分子,例如TLRs激活通路、IL-1和IL-18受体通路。

TLR2-/-或TLR4-/-对DSS诱导性结肠炎的敏感性与MyD88-/-相似,但是它们的临床表现更轻,可见MyD88的保护作用是由TLR4和TLR2等多条通路共同作用的结果。

他们还研究了受体作用蛋白2(RIP-2)的MyD88依赖性炎症通路,RIP-2是细胞质PRRs(NOD1和NOD2受体)的调控因子、可以激活NF-κB转录分子和MAP激酶,但是研究结果显示RIP2-/-小鼠对DSS的敏感性并没有明显增强。DSS 诱导性小鼠实验表明,MyD88在调控上皮细胞的损伤耐受性和损伤后修复中起了重要作用。

此外,多种MyD88诱导性细胞因子参与上皮耐受和再生过程,特别是IL-6,IL-6可以促进胃肠伤口的愈合。TLR/MyD88通路可以通过NF-κB转录因子调控IL-6基因表达。此外,TLR/MyD88通路还可以上调DSS损伤后野生型小鼠体内IL-6的表达。相反,DSS损伤后MyD88敲除小鼠体内的IL-6水平却不会上调。

此外,由于抗生素治疗可以抑制野生型小鼠IL-6的产生,所以有人认为共生菌可以影响MyD88信号通路及诱导IL-6产生。野生型小鼠在接受DSS损伤后IL-6生成量剧增,而抗生素治疗可以抑制IL-6生成,所以这些小鼠和MyD88-/-小鼠一样出现严重结肠炎(图1)。

图1. Rakoff-Nahoum团队所提供的模型示意图

TLR4/TLR2/Myd88通路由共生菌激活,在维持上皮稳态中发挥了重要作用(A)。TLR4/TLR2/Myd88信号通路缺失会降低上皮的耐受性,细菌移位,从而促进结肠炎和肿瘤发生(B)。IECs:肠上皮细胞;TLR:Toll样受体;CRC:结直肠癌;IL-6:白介素-6;MyD88:髓样分化因子88。

然而,Rakoff-Nahoum团队并没有研究注射外源性IL-6是否可以恢复小鼠上皮细胞耐受DSS的能力。此外,他们也没有分析MyD88诱导性IL-6是由哪种细胞产生。间质巨噬细胞可能是IL-6的主要来源,然而上皮细胞也可以产生TLRs、MyD88 和IL-6。

Rakoff-Nahoum团队研究了MyD88与TLR4受体和TLR2受体之间的作用。他们选用了TLR4-/-和TLR2-/-小鼠,TLR4的特异性抑制剂LPS和TLR2的特异性抑制剂LTA。研究结果显示,不管LPS或LTA同时给药与否,共生菌可以完全消除小鼠对DSS诱导性结肠炎的耐受性。

上述结果表明,TLR4或TLR2通路是维持上皮稳态所必需的。虽然他们没有研究MyD88-/-小鼠模型与DSS+AOM诱导性肿瘤发生是否相关,但是他们证实了任何炎症相关的细胞或因子均可以升高肿瘤发生的风险。

NLRS/caspase 1/caspase 12/IL-18通路Dupaul-Chicoine等对caspase 1和caspase 12在结肠炎和结肠炎相关结直肠癌发生中的作用进行了研究。结直肠炎症过程中,在间充质细胞和上皮细胞内以caspase 1炎性体为终端的信号通路均会被激活。

Caspase-1是多个细胞内受体的下游靶点,特别是NLRs。Caspase-1可以调控pro-IL1beta和pro-IL-18的蛋白水解过程,从而诱导“炎症细胞死亡”,即所谓的细胞焦亡(pyroptosis)。Caspase-1与caspase 12相互拮抗,后者可以抑制炎症反应的发生。

在炎症通路的终端,IL-8发挥了十分“简单”但又复杂的作用。外周血和粘膜组织的IL-18水平升高与炎症性肠道疾病相关。Sivakumar团队借助DSS诱导性结肠炎小鼠模型和IL-18特异性抑制剂(IL-18结合蛋白,IL-18bp.Fc)进行了一项研究。

IL-18结合蛋白可以缓解炎症性肠道疾病的临床表现(例如,体重降低),还可以上调多种促炎症因子,例如IL-1alpha、IL-1beta、TNF-alpha和IFN-gamma。然而,与这些研究结果相反的是,人类由基因突变所造成IL-18通路功能降低与炎症性肠道疾病的发生密切相关。

有人推测IL-18可能具有双重作用:(1)在生理条件下,IL-18可以通过诱导上皮细胞再生和伤口愈合维持上皮稳态;(2)在病理条件下,上皮屏障受到破坏、发生化学性或微生物性结肠炎,IL-18可以维持胃肠道基质中的过度炎症反应,从而升高了结肠炎相关结直肠癌的风险。

Dupaul-Chicoine 团队评估了三种不同基因型(野生型、caspase 1-/-型和 caspase 12-/-型)小鼠对DSS处理后结肠损伤的修复能力。由于caspase 1可以促进炎性体形成和炎症反应发生,所以研究人员希望Casp1-/-小鼠模型经DSS处理后的结肠炎缓解。然而,他们却发现caspase 1在损伤后上皮细胞增殖和再生中发挥了重要作用。

有趣的是,与野生型小鼠一样,Casp 12-/-小鼠肠道上皮在DSS损伤后的第9天恢复。此外,Casp 12-/-小鼠在实验结束时也表现出超强的组织修复能力,这表明caspase 12可能是损伤和修复过程中过度组织重建的调控分子。

IL-18是caspase-1通路的终端产物,注射外源性IL-18可以完全恢复Casp1-/-小鼠对DSS诱导性结肠炎的敏感性,这表明IL-18在caspase-1依赖性上皮再生中发挥了重要作用。有趣的是,casp12-/-小鼠表现出一系列的“特殊疾病”。

尽管casp12-/-小鼠可以恢复到野生型小鼠的“临床表观”水平,但是小鼠的胃肠道间质炎症并没有缓解,巨噬细胞浸润反而加重和炎症因子(COX2、Bcl-xl、cyclin D1、IL-1、IL-6、TNFa、MCP-1、Il11、ccl7和TNFa-诱导蛋白2)表达同样增强。此外,相比野生型小鼠,casp12-/-小鼠对低剂量DSS诱导性结肠炎更敏感。

可见,Caspase 1和caspase 12共同缺失可以明显促进DSS+AOM 小鼠模型中肿瘤的发生,这表明慢性炎症反应在结直肠癌发生中起了重要作用。

IL-18/IL-18R/MYD88通路Salcedo团队研究了小鼠MyD88缺失是否与结直肠癌发病增加相关。他们发现,相比野生型小鼠,经AOM处理后Myd88-/-小鼠的结肠息肉数量更多,这表明促炎症反应可以增强AOM的促肿瘤效应。然而,研究显示Myd88-/-小鼠的上皮细胞增殖和上皮再生同样受到抑制。

此外,他们还进行了AOM/DSS诱发性Myd88-/-小鼠和野生型小鼠的基因表达谱分析,以寻找细胞增殖相关基因的表达差异。他们发现,Myd88-/-小鼠在经AOM/DSS处理后,表皮生长因子受体、Met和beta-catenin信号通路均被激活,这表明存在一种可以维持结肠黏膜完整性的补偿机制。

上述研究表明,机体对共生微生物的先天性免疫反应是肠道上皮预防炎症反应和肿瘤所必需的,它不仅具有杀菌作用,还是上皮细胞周期调控的主要方式。使用抗生素会打乱肠道的生态环境,从而诱发癌症。换句话说,先天性免疫途径是慢性结肠炎相关肿瘤发展所必需的,它主要通过“炎症性恶性循环”发挥作用。

“炎症刹车分子”在肿瘤发生中的作用

除了caspase-12外,Dupaul-Chicoine团队还研究了“炎症刹车分子(inflammatory brake)”的作用,结果显示炎症刹车分子可以抑制炎症反应。

SIGIRR:SIGIRR是TLRs通路的细胞内抑制剂。与TLR4-/-和TLR2-/-小鼠相同,SIGIRR-/-小鼠对DSS有很高的敏感性,这表明SIGIRR缺失可以促进DSS诱发性结肠炎的发生,其作用机制可能与TLR4-/-、TLR2-/-和MyD88-/-小鼠模型中上皮内稳态损伤机制不同。

研究发现,上皮SIGIRR是机体对共生微生物正常免疫反应的调控因子。如果SIGIRR缺失,机体对正常微生物的炎症反应会失控,从而破坏上皮稳态、增加机体对DSS诱导性结肠炎的敏感性以及对AOM+DSS诱导性肿瘤的敏感性。然而,SIGIRR是IL-18/IL-18R通路的抑制剂,可见它在上皮再生中发挥了重要作用。

NLRP6: 另一个“炎症刹车分子”是NLRP6。它是NLR家族的一员,该家族均带有热蛋白结构域。有些NRLs(例如,NOD1和NOD2)可以通过NF-κB和MAPK信号通路诱导抗菌因子的表达,而其他NRLs(例如,NLRP1、NLRP3和NLRC4)可以促进炎症反应的发生以及炎性体蛋白复合物的形成。

最近研究发现,NLRP6可以下调肠道的炎症反应,从而预防慢性结肠炎和后续的肿瘤发生。NLRP6主要表达在结肠粘膜的纤维原细胞上,它的缺失与DSS处理后的炎症反应加剧相关。相比野生型小鼠,nlrp6-/-小鼠的结肠炎相关指标更为严重,例如体重减轻、直肠出血和腹泻。

此外,NLRP6缺失还与DSS+AOM小鼠模型的肿瘤形成相关。总之,这些关于“炎症刹车分子”的研究表明:所有细胞分子(正或负调节因子)都是维持上皮稳态和抑制肿瘤发生所必需的。改变促炎症因子和/或抗炎症因子均会带来促结肠炎或促肿瘤效果。

IL-23/IL-17与结直肠癌

IL-23/T辅助17细胞(Th17)是炎症性肠道疾病和结直肠癌发展中的重要病因因子。IL-17和Th17促炎症作用或抗炎症作用相关的研究仍开展之中。Th17细胞是一类可以产生IL-17的T辅助细胞。Th17细胞的形成不同于Th1细胞和Th2细胞,它在自身免疫性疾病中发挥了重要作用,例如克罗恩氏(Crohn’s)病。

研究发现,Th17细胞的主要生理作用是在机体上皮/粘膜接口感染多种细菌和真菌的情况下诱导产生IL-17。在Th17细胞释放的多种细胞因子中,IL-22可以刺激上皮细胞产生特异性的抗菌蛋白。Th17细胞缺失可以提高机体对机会性感染的敏感性。

目前尚不清楚初始T细胞如何突变和分化成为Th17细胞。这个过程涉及了多种细胞因子,比如转化生长因子-β(TGF-β)、IL-6、IL-1、IL-21、IL-23、IFN-ɤ和IL-4。IFN-ɤ和IL-4分别是诱导Th1细胞和Th2细胞分化的主要细胞因子,但是研究发现它们可以抑制Th17细胞的分化。

此外,IL-23是诱导Th17细胞产生IL-17的主要因子。Th17细胞浸润与根除性手术结直肠癌患者的无病生存率降低相关,这可能与Th17细胞的免疫抑制作用相关。Grivennikov团队发现,相比周围正常粘膜组织,结直肠癌患者肿瘤组织中的IL-23和IL-17表达水平显著升高。

此外,他们还借助小鼠结直肠癌模型研究了IL-23和IL-17的作用。研究显示,小鼠结直肠癌模型中的IL-23和IL-17表达上调,这种表达上调发生在肿瘤发展早期阶段。流式细胞术分析显示,IL-23主要是由肿瘤组织中浸润到基质的CD11b+和F4/80+髓细胞产生。

小鼠敲除IL-23后,IL-23诱导性细胞因子(IL-17、IL-6和IL-22)和上皮STAT3的磷酸化作用均会丧失,自发性结直肠癌癌灶组织的数量和体积会减少。敲除IL-17受体也会抑制自发性结直肠癌的发生。肠道共生菌是维持肠道产生基线水平IL-23的主要因素,该过程主要通过先天性免疫TLRs和MyD88完成。

另一项动物实验结果显示,敲除MyD88可以降低IL-23和IL-17水平,从而抑制自发性肿瘤的形成,这表明IL-23/Th17信号通路在先天性免疫中发挥了重要作用。向小鼠移植含有MyD88感受态细胞的骨髓可以有效地抑制这种作用。广谱抗生素同样可以抑制结肠细胞合成IL-23,以及自发性肿瘤的形成。

Grivennikov团队发现小鼠癌前病变与粘蛋白产生和上皮屏障稳态紊乱相关,这表明共生菌的移位可以促进固有层的髓细胞产生IL-23。他们认为致癌突变发生之后,结肠腺瘤的上皮屏障破坏,屏障下层髓细胞激活,最终促进腺癌的发生发展。

另一项小鼠小肠自发性肿瘤模型同样验证了IL-17和结直肠癌发生之间的关系。尤其是,一种人体肠道共生菌-产肠毒素脆弱类杆菌(enterotoxigenic Bacteroides fragilis)可以促进肠道肿瘤的形成,但是IL-17或其受体封闭却可以抑制肿瘤的发生。

Hyun团队最近开展的一项动物研究表明,IL-17在结肠炎相关结直肠癌发展过程中起了重要作用。的确,阻断IL-17信号通路可以显著降低IL-6、STAT3、TNF-alpha和IFN-gamma的表达水平。此外,肠隐窝和肿瘤组织的Ki-67阳性细胞数均显著减少,这可能与b-catenin、周期蛋白D1、周期蛋白依赖性2和周期蛋白E表达水平降低有关,这表明IL-23/Th17信号通路在肿瘤发生早期起了重要作用。

结直肠癌诱发性免疫反应

一旦结直肠癌癌灶出现,大量免疫细胞就会参与到结直肠癌发展过程中,发挥促进肿瘤或抑制生长作用(表 1)。

表1:参与结直肠癌发展过程中免疫反应的多种细胞类型

肿瘤组织的细胞毒性免疫细胞浸润

大量研究表明,浸润细胞毒性淋巴细胞(适应性免疫)对多种类型肿瘤的预后具有促进作用。临床研究和转化研究的关键是寻找结直肠癌患者的免疫预后因子。2009年Pagès团队开展了一项基础研究,他们发现CD8+细胞和CD45RO+细胞共表达是早期、根除性切除结直肠癌患者复发情况和总体生存率的预测因素。

研究发现,在15例记忆性CD45RO+细胞高表达的肿瘤组织中CD8细胞毒性和Th1定位相关基因簇表达上调,特别是CD8、颗粒酶、穿孔素、T-bet、干扰素-gamma、IL-12Rb 1、IL-12Rb 2和IL-18基因。一项包括411位结直肠癌患者的队列研究结果显示,CD8+和CD45RO+的表达量越低、患者的死亡风险越高。

多变量分析结果显示,CD8+细胞和CD45RO+细胞浸润、pT分期和肠穿孔是结直肠癌患者预后的独立预测因素。另一项包括191位结直肠癌患者队列研究进一步验证了这个结果。相比常规分期系统,原发性肿瘤的细胞毒性CD8阳性和记忆性CD45RO阳性T细胞浸润(即所谓的immune score,免疫评分,Im)的预后能力更强。

此外,结直肠癌患者免疫评分(Im)越高,无病生存期越长、总体生存率越高。根据原发性肿瘤中心区域和侵袭边缘CD8+细胞或CD45RO+细胞的数量对患者的肿瘤进行免疫评分,等级从Im0-Im4。在一个包括415位结直肠癌患者的研究中,免疫评分为Im0、Im1、Im2、Im3和Im4患者的比例分别为9%、12%、27%、22%和30%。

免疫评分为Im4、Im1和Im0患者的5年无病生存率分别为85%、53%和32%。免疫细胞浸润与肿瘤分期显著相关,肿瘤I期-IV期肿瘤患者的CD8+细胞数量降低50%。该团队的另一项研究结果显示,效应T细胞可以有效抑制早期淋巴血管栓塞等肿瘤行为的发生。

我们还对转移性结直肠癌患者的CD45RO、PD-1和TLR4免疫通路的外周表达情况进行了评估,结果显示:记忆性CD8+CD45RO+细胞对转移性肿瘤患者的预后价值。这项前瞻性研究共纳入31位结直肠癌患者,他们正接受一线化疗药物氟尿嘧啶(fluorouracil)、伊立替康(irinotecan)和贝伐单抗(bevacizumab)的治疗。

在第一轮化疗和第三轮化疗前抽取患者的血液,用流式细胞术分析CD4+、CD8+、CD45RO+和PD1+单核细胞的数量、以及嗜中性粒细胞的TLR4表达情况。患者的免疫细胞在两轮化疗过程中发生了明显变化,这具有一定的预后价值。

第三轮化疗前的CD45RO+CD8+细胞数量与无进展生存期(PFS)(CD45RO+CD8+细胞数量>12%或<12%患者的中位无进展生存期分别为22.4和9.4月)和总体生存率(cd45ro+cd8+细胞数量>12%或<12%患者的2年总体生存率分别为62%和44%)显著相关。

Cox回归多变量分析结果显示,CD45RO+CD8+细胞是无进展生存期的唯一独立预后因子。研究发现,Th1细胞定位对结肠炎相关结直肠癌具有保护作用。最近研究表明,与野生型小鼠和Th2- IL4-/-小鼠相比,INF-gamma缺失小鼠经三硝基苯磺酸处理后体内会出现大量肿瘤。

基于这些实验结果可以发现,在结肠炎的情况下Th2主导性细胞因子反应会促进结直肠癌的发展。此外,Th2相关细胞因子(例如,IL-4和IL-13)也会上调激活诱导胞啶脱氨酶(AID),这种酶可以诱发结肠上皮细胞的DNA突变,从而促进肿瘤发展。

Bindea团队对结直肠癌发展过程中的28种免疫细胞进行了分析,他们发现:随着肿瘤发展,肿瘤组织中的细胞毒性T细胞和B细胞越来越少,而T辅助性滤泡细胞越来越多。这种免疫细胞数量变化可能是因为机体的CXCL13/IL-21信号增强。

上述结果表明,原发性肿瘤和转移性肿瘤中存在一种适应性、肿瘤特异性免疫反应。这种免疫防御主要是细胞毒性Th1细胞定位性的,尽管它不能完成“肿瘤清除”任务,但是它可以抑制肿瘤发展和转移。

T调节细胞在结直肠癌发生发展中的作用

T调节细胞(Tregs)属于CD4+细胞,它可以有效抑制机体的特异性免疫反应、维持自我耐受性,从而预防自身免疫性疾病的出现。T调节细胞参与肿瘤发生,它们可以抑制抗原特异性T细胞的抗肿瘤效应。研究发现,结直肠癌患者的外周血和肿瘤组织均含有大量的T调节细胞。

的确,肿瘤患者体内经常出现特异性免疫T细胞对肿瘤相关抗原的反应,然而有效的免疫介导肿瘤清除并不常见,可见T调节细胞发挥了重要作用。在免疫能力不强的患者体内,T细胞可以浸润肿瘤组织,这是良好预后的一个公认指标。特别是,浸润性CD3+细胞和FOXP3+细胞比例升高与无病生存期改善相关。

此外,小鼠模型中循环性T调节细胞减少与肿瘤移植物、化学物质诱导性肿瘤的排斥反应相关。结直肠癌患者体内的T调节细胞产生是抗原特异性的。Betts团队研究发现,与年龄匹配的健康人相比,在进行根治性切除手术前12-52周肿瘤患者体内的外周血和肿瘤组织淋巴细胞主要分布在结直肠癌组织。

与对照组T调节细胞相比,手术前肿瘤患者外周血T调节细胞的FOXP3表达量升高20%。FOXP3的表达量与T调节细胞的抑制能力相关,结直肠癌患者体内的T调节细胞活性增强。相比之下,肿瘤组织中的T调节细胞含量比外周血要高,血液中FOXP3+细胞比例仅为15%,而肿瘤间质中FOXP3+细胞比例高达50%。

肿瘤患者肠粘膜T调节细胞的原因可能是特定整合素和粘附因子表达量的增加,例如CD49d。Deng团队对外周血单核细胞(PBMCs)和肿瘤引流淋巴结中的淋巴细胞进行了对比,结果发现血液和外周组织中的FOXP3+细胞比例存在同样的差异。

令人更加感兴趣的是,结直肠癌患者术后外周血T调节细胞FOXP3表达量显著降低,不过在随访期间患者的T调节细胞FOXP3表达量逐渐趋于正常。机体对特定肿瘤抗原(例如,5T4)的特异性免疫反应在术前受到抑制,在术后6个月恢复正常,这可能与T调节细胞活性抑制程度降低相关。

此外,术前结直肠癌患者的T调节细胞介导性免疫抑制明显升高,其中有10位患者在术后1年恢复正常,而其他34位患者在术后没有明显改善。T调节细胞在结直肠癌中的作用似乎可以解释为什么接种抗肿瘤疫苗对预防结直肠癌是无效的。

然而,其他研究发现肿瘤浸润性T调节细胞数量增加与结直肠癌患者预后改善相关。因此,有人建议将T调节细胞用于抑制结直肠癌患者体内的促肿瘤炎症反应。

其他参与结直肠癌发展的免疫细胞:巨噬细胞、骨髓细胞和嗜中性粒细胞

肿瘤相关巨噬细胞在结直肠癌发展中起了重要作用,可以将其分为两类:经典活化巨噬细胞(classically activated macrophages,M1),一般由IFN-gamma和LPS诱导;替代激活巨噬细胞(alternatively activated macrophages,M2),一般由IL-4和IL-13诱导。

经典活化巨噬细胞可以通过产生TNF-alpha、IL-6和IL-12等细胞因子促进抗肿瘤免疫反应,而替代激活巨噬细胞可以通过产生TGF-γ和IL-10等细胞因子抑制抗肿瘤免疫反应。经典活化巨噬细胞和替代激活巨噬细胞之间的平衡决定了促肿瘤环境或抗肿瘤环境。

最新研究表明,骨髓源细胞是肿瘤免疫的强效抑制细胞,所以它是肿瘤免疫疗法的主要障碍。“骨髓源抑制细胞”(MDSC)是早期髓样祖细胞、不成熟粒细胞、巨噬细胞和不同分化阶段的树突细胞的异源群体,通常聚集在患者和动物的血液、淋巴结、骨髓和肿瘤位置,发挥抑制先天性免疫和适应性免疫的作用。

骨髓源抑制细胞一般由肿瘤分泌和宿主分泌的因子激活,特别是促炎症因子。可见,炎症作用可以促进骨髓源抑制细胞的聚集,从而下调适应性免疫监督和抗肿瘤免疫,最终促进肿瘤的发展。相对来说,很少有人知道嗜中性粒细胞在肿瘤中的作用。

肿瘤细胞和基质细胞可以分泌多种因子,从而提高转移性结直肠癌患者体内的嗜中性粒细胞数量(中性白细胞增多症),嗜中性粒细胞似乎具有免疫抑制活性。嗜中性粒细胞诱导因子主要包括血管内皮生长因子-A、IL1-beta和IL-6。

嗜中性粒细胞可以直接吞噬外源性微生物(例如真菌和细菌)或是通过释放激活性细胞因子(TNF-γ、IL-1和干扰素)、防御素和有毒物质(活性氧)等物质杀死外源性微生物。

尽管通常认为嗜中性粒细胞具有抗菌活性,然而脾脏、骨髓和血液中均存在肿瘤相关嗜中性粒细胞(TAN)、外周血嗜中性粒细胞和粒细胞骨髓源抑制细胞,这些细胞在肿瘤发病环境下扮演免疫抑制细胞的身份。

最近研究发现,在未经治疗的肿瘤组织中,嗜中性粒细胞发挥一种促肿瘤发展作用,这与巨噬细胞相似,又被称为“N2”表型。尽管目前尚不清楚嗜中性粒细胞促肿瘤作用的具体机制,但是已经发现嗜中性粒细胞可以影响血管新生、免疫监督,以及趋化因子、细胞因子和活性氧分泌等过程。

然而,在特定环境(例如,TGF-β阻断)下,肿瘤相关嗜中性粒细胞会出现“N1”表型,这是一种具有促炎症反应和抗肿瘤活性的表型。有趣的是,最近研究结果表明:可以将外周血嗜中性粒细胞作为结直肠癌的“预后和预测指标”列入淋巴细胞比率。

结论

大量研究已经对结直肠癌患者的免疫反应进行了分析,很多肿瘤-免疫相关的假设已经受到质疑。例如,先前“炎症通路活化具有不利影响”的理论就受到挑战,因为炎症通路活化在维持上皮内稳态中发挥了重要作用。

机体对结直肠癌的免疫、炎症反应十分复杂,此外还要根据癌症发生阶段(癌前病变和浸润性癌症)、肿瘤分期和微环境(共生生态学)对结直肠癌和免疫/炎症反应间的关系作出调整。综上,可以得出一个结论:免疫反应和上皮/肿瘤细胞间存在一种微妙的平衡关系,破坏或偏离这种平衡均会有致癌或促进肿瘤风险。

治疗性免疫干预应该是多靶点、调控准确的。最佳的结直肠癌免疫疗法是协作治疗,其中包括增强细胞毒性免疫反应、抑制促肿瘤的T调节细胞、Th17细胞和炎症细胞、以及重塑正常宿主/微生物共生体系。

编辑: liyue    来源:丁香园

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