非小细胞肺癌的免疫治疗
背景
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，每年新确诊肺癌患者达到160万，肺癌同时也是癌症患者死亡的首要病因，每年有140万的人口死于肺癌。
针对易感基因EGFR出现变异和其他的致癌基因的激活的治疗能够使得较晚期的NSCLC患者的获得较好的疗效，但这些疗法并不能改善患者的生存率，研究学者们仍在继续寻找新型的治疗方法。
肿瘤的发生不仅仅是由于癌细胞的本身的特性，其与免疫系统之间的相互作用也起着重要作用。临床上用于癌症治疗的免疫疗法较多，如Sipuleucel-T （一种抑制前列腺癌细胞转移的疫苗），伊匹单抗和白介素-2(IL-2)(治疗晚期黑色素瘤)，白介素-2(IL-2)（治疗肾细胞癌）。
但由于采用BCG、白介素-2(IL-2)和干扰素治疗的疗效不佳，NSCLC曾一度被认为是无免疫活性的肿瘤。但是，随着新一代癌症疫苗和免疫调节剂的成功研发，NSCLC的免疫治疗再次引起的大家的兴趣。
尽管在早期的研究中看到了疫苗治疗的前景，但许多III期临床试验的结果却并不理想。在当地技术领先的医疗机构中进行的Tecemotide（START 研究）和belagenpumatucel-L （STOP 研究），以及辅助医疗机构中进行的研究提示均无治疗作用。
由于基因和表观遗传学的差异，癌细胞抗原的表达不同于宿主细胞抗原表达。免疫系统清除癌细胞的第一步就是能够识别肿瘤细胞。随后，肿瘤细胞抗原提呈到T细胞，使得T细胞激活，最终杀灭肿瘤细胞。T细胞介导的免疫反应受到激活和抑制信号的双向调节。
免疫协同刺激分子包括CD28，CD137,糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子（TNF）受体（GITR）和OX-40。负向调节分子，免疫检查点分子能够防止免疫反应的过度激活。检查点分子（协同抑制分子）包括细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4），程序化死亡1（PD-1），TIM3，淋巴细胞激活基因3（LAG3）和杀伤细胞免疫球蛋白受体（KIR）。
正常的生理情况下，这些免疫检查点能够保护机体免于自身免疫和炎症的伤害。在肿瘤状态下，这些免疫检查点蛋白无法正常发挥功能，从而引起肿瘤耐受，最终使得肿瘤细胞逃过免疫系统的追杀。
以这些分子为靶点，采用抗体进行免疫调节的研究越来越多，并且部分取得了可喜的成果。来自新加坡国立大学肿瘤研究所的Raghav Sundar博士等对协同刺激分子和协同抑制分子调节机体对肿瘤的免疫反应，和近期的研发的治疗方法进行一综述，并近期发表在Lung Cancer杂志上。
2.协同抑制干预
2.1 CTLA4
抗原提呈细胞（APC）上的主要组织相容性复合体和APCs结合的B7分子与T细胞上的CD28受体结合将抗原提呈到T细胞受体（TCR），进而激活CD4和CD8T细胞。B7有两个配体亚型，为B7.1或CD80和B7.2或CD86。细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）同样能与B7结合，与CD28竞争性作用，发挥抑制效应。
CTLA4与B7结合后，释放能够使得T细胞重新转变为抑制性T细胞的信号分子。在T细胞激活后才能上调CTL4分子，这种效应只有在幼稚T细胞中才能检测得到。CTLA4还能减少IL2的生成、IL2受体表达和直接抑制TCR信号分子的作用。CTLA4的激活可引起抗原特异性T细胞的外周耐受。
CTLA4敲除小鼠出现了显著和致死性的淋巴细胞浸润，表明CTLA4在抑制T细胞活性中发挥着重要作用。CTLA-4的表达不仅仅存在于T淋巴细胞，研究者还在51-87%的病例的NSCLC肿瘤细胞中检测到NSCLC的表达。
其中的一项研究表明CTLA4与非鳞状上皮组织相关，但与总体生存率无关。但在另一项研究中CTLA4肿瘤的表达与年老和肿瘤低分化相关。
抑制CTLA4所带来的抗肿瘤效应是通过减轻对CD28/B7T细胞活性的抑制而得以实现的。同时还会引起Tregs减少，最终引起机体对对肿瘤相关抗原快速发生免疫应答。CTLA4抑制剂，Ipilimumab，被认为是晚期黑色素瘤的有效治疗手段，现在的研究将其应用在NSCLC的治疗之中。
Ipilimumab为人单克隆抗体，可与CTLA4相结合，因此，CTLA4能够防止其与相应的配体结合，并减轻对CD28/B7T细胞活性的抑制。CTLA4的抑制能够引起机体对肿瘤相关抗原产生快速的免疫应答。
在一项随机的II期临床试验中，晚期的NSCLC患者被随机分入3个不同的治疗组。所有的治疗组均接受6轮的紫杉醇和卡铂化疗。
第1组（早期应用组）患者在第1-4轮化疗的第1天期间接受ipilimumab治疗，在最后2轮化疗则改为联用安慰剂治疗。第2组（延迟应用组）在头两轮化疗中联用安慰剂，而在第3-6轮化疗的第1天采用ipilimumab治疗。第3组（对照组）则仅接受联合安慰剂治疗。前两组患者完成化疗后，依然每12周接受1次ipilimumab，直到病情出现进展。
将免疫相关应答标准考虑在内免疫相关的无进展生存率（irPFS）为该研究的主要研究终点。在延迟应用组中，irPFS为5.7 VS 4.6个月，而在早期应用组中，irPFS则未见改善。在延迟应用组中，OS的改善无统计学意义。尽管无统计学意义，但鳞状细胞癌患者的OS更长。
该疗法的副反应为皮疹、瘙痒和腹泻。早期应用组3/4级irAE的比例为20%，晚期应用组为15%，而对照组为6%。因ipilimumab引起的中毒性表皮坏死溶解症死亡1例。
一项针对NSCLC中的鳞癌大型的III期临床试验正在进行中。Ipilimumab联用EGFR和ALK酪氨酸激酶抑制剂的研究也在进行中。同时也有研究在探讨ipilimumab在小细胞肺癌中的作用。
Tremelimumab，与ipilimumab类似的单克隆抗体正处于预治疗的晚期NSCLC病人的II期临床试验阶段。所有患者均在接受了4轮的铂类化疗之后被研究者分入两个治疗组，即Tremelimumab组和最好的维持疗法组。ORR为5%，PFS两组无差异。
2.2 PD-1
CD4和CD8淋巴细胞，Tregs，B淋巴细胞和NK细胞上均表达PD-1受体。已知的PD-1的配体包括PD-L1（或CD274，B7-H1）和PD-L2(CD273，B7-DC)。PD-1与PD-L1或PD-L2会引起细胞因子的生成减少，减少细胞增殖和细胞溶解。在多种肿瘤中，肿瘤浸润T淋巴细胞（TILs）的PD-1的表达上调，然而许多肿瘤的PD-L1表达也增多。
因此可以推测其机制为肿瘤细胞能够诱导T细胞失能，避免APCs提呈能够识别肿瘤的肿瘤抗原。PD-1拮抗剂包括PD-L1抗体，如nivolumab，lambrolizumab和pidilizumab，以及融合蛋白AMP-224。
Nivolumab为完全的人IgG4单克隆抗体，尚无可检测的依赖细胞毒性的抗体（ADCC）。
在晚期实性肿瘤的I期临床研究中，每两周增加一次的nivolumab的用量，共治疗12轮（2年）。在NSCLC队列研究中（n=129），大部分患者均曾接受了多次的化疗，其中55%的患者至少接受过3种治疗方案。
中位数反应疗程（74周）时的ORR为17%。中位数生存率为9.9个月，1年和2年生存率分别为42%和24%。中位数PFS仅为2.3个月。
Nivolumab的总体耐受性良好，皮肤毒性（20%），胃肠反应（15%），肺部症状（9%）为最常见的不良事件。与ilipmumab相比，Nivolumab的胃肠道毒性发生率低。出现肺炎的患者有2例死亡。
对63/129例患者进行了PD-L1表达的生物标记物分析，若至少5%的肿瘤细胞免疫组化染色可见PD-L1表达则为PD-L1阳性，PD-L1的阳性率为43%。PD-L1阳性患者和PD-L1阴性患者的ORR分别为16%和13%，表明在经过治疗的研究组中，长期存放的的肿瘤组织并不适于检测PD-L1的表达。
将nivolumab和紫杉醇治疗NSCLC的鳞癌或NSCLC的非鳞癌的疗效进行比较III期临床试验的入组已经完成，结果也即将公布于众。
Lambrolizumab是以PD-1为靶点的单克隆抗体，在黑色素瘤的治疗中具有抗肿瘤的活性。某项以NSCLC患者为研究对象的I期临床试验发现，采用Lambrolizumab治疗的中位数生存时间为51周，采用免疫相关的应答标准确定的部分有效率为25%。常见的不良事件为乏力、皮疹和瘙痒，1例患者出现肺炎，1例出现肺水肿。
在肿瘤标记物检测的研究中，采用治疗前取得的新鲜的肿瘤组织进行免疫组化染色得到的肿瘤细胞上的PD-L1表达预测治疗反应，PD-L1阳性和PD-L1阴性的ORR分别为67%和4%。基于上述结果，一项比较lambrolizumab和紫杉醇对PD-L1阳性的晚期NSCLC患者疗效的随机的II/III期临床试验已经开展。
2.3 PD-L1
程序性死亡受体配体1（PD-L1，B7-H1）,为PD-1的配体，属于B7超家族的一员，参与免疫应答的负性调节。T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞可表达PD-L1，在包括NSCLC在内的许多实性肿瘤中，PD-L1的表达上调。
由于细胞因子，如IL-4、IL-10、INF-а、-B或-γ，的诱导，PD-L1会激活T细胞上的PD-1，并且下调T细胞效应器的功能，同时是肿瘤细胞得以侵入宿主免疫监控的机制之一。27-57.5%的NSCLC细胞表达PD-L1，并且PD-L1存在于细胞膜和/或细胞浆中。在肉瘤样NSCLC中，PD-L1的表达比例为69%，远高于普通NSCLC的27%。
PD-L1对预后的影响尚不清楚，各种结果之间相互矛盾。结果的差异可归因于不同研究中检测PD-L1表达和对其进行评分的方法学存在差异。有研究认为，PD-L1的表达与肿瘤的血管侵犯和高分化有关，但不能改善无复发生存率。
PD-L1表达与巨噬细胞和树突状细胞的增多和炎症浸润程度增加有关。与之相反的是，有研究发现PD-L1的表达与TILs呈负相关。
在组织学上，PD-L1的表达与鳞癌相关，但有一项研究表明腺癌也与之相关。某项研究发现PD-L1的表达与EGFR/KRAS突变或ALK重排无关。考虑到PD-L1在肺癌中所起的重要作用，抑制PD-L1成为了有前景的治疗方法。目前在研的PD-L1抑制剂包括单抗MPDL3280A,BMS-936559，MEDI4736和MSB0010718C。
在某项I期临床研究中，BMS-936559对实性肿瘤的治疗中，治疗NSCLC的ORR为10%，18%的患者经历了至少24周的病情稳定期。但由于花费巨大,BMS-936559的研发被迫停止。
MPDL3280A为合成的IgG抗PD-L1抗体，含有调整后的Fc结构域，从而防止其他细胞因抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）作用而表达PD-L1。
在MPDL3280A的I期临床研究中，治疗曾接受治疗的晚期NSCLC患者的ORR为24%，24周PFS为46%。患者肿瘤表达PD-L1阳性和阴性的ORR分别为100%和15%。既往/现正吸烟者的ORR为25%，而非吸烟者为16%。
MEDI4736，与MPDL3280A类似，均为合成的含有一个三级突变的Fc结构域，从而避免Fc介导的ADCC。以往治疗实性肿瘤患者的I期临床研究表明，其在包括NSCLC在内的不同肿瘤中的临床活性和疾病稳定期的时长均无剂量限制毒性，无3-4级治疗相关不良事件。
2.4 TIM3
与其他免疫检查点分子不同的是，TIM3并非在所有T细胞激活后得以上调，仅在CD4+辅助T细胞1（Th1）和CD8+细胞毒性T细胞中上调，参与协同抑制作用。在由其配体galectin-9激活后，TIM3会抑制效应T细胞的活性，并引起外周耐受。TIM3在T细胞在肿瘤中的损耗中起着关键作用。
在黑色素瘤患者中，可检测到TIM3与PD-1共表达；这一共表达表明肿瘤中CD8+T细胞的大量损耗。在NSCLC患者中，仅CD4+和CD8+的TILs中的TIM3表达上调，外周血T细胞不出现这一变化。CD4+T细胞中TIM-3的表达与淋巴结转移和肺癌晚期相关。
某项临床前研究表明，在部分实性肿瘤的治疗中，联合抑制TIM3和PD-1的效果优于单独抑制疗法。
2.5 LAG3
淋巴细胞激活基因3(LAG3)为激活的T细胞、Tregs、树突状T细胞和NK细胞上表达的协同抑制受体。LAG3何为CD4相关蛋白，与II型主要组织兼容性复合物（MHC）介乎额，抑制T细胞增殖，从而导致肿瘤侵犯。在二氧化硅介导的动物模型肺部炎症可观察到LAG3基因表达上调。
LAG3单克隆抗体治疗晚期实体肿瘤的BMS-986016的I期临床研究正在进行中。
2.6 KIR
KIR作为NK细胞家族的调节物，近期成为了多种肿瘤免疫治疗的新靶点。KIR对NK细胞效应器功能起负性调节作用。抑制KIR会引起NK细胞的抗肿瘤活性。Lirilumab为与KIR2DL1-2和3受体结合的抗体，可引起NK细胞介导的细胞杀伤。NSCLC患者KIR2DL1共表达的增多已见报道，这一现象会降低NK细胞的功能。
两个针对Lirilumab联合ipilimumab和nivolumab治疗NSCLC的I期临床研究正在研究当中。
2.7BTLA和A2AR
协同抑制受体B和T淋巴细胞弱化子（BTLA）在自体免疫中的作用和其配体与淋巴瘤生成相关的疱疹病毒进入介质（HVEM）已被研究。A2A腺苷受体（A2AR）为G蛋白耦联受体，可与腺苷结合，对MAPK激酶通路有调节作用。目前尚无这些分子在肺癌中的研究。
3.协同刺激干预
3.1 OX40
OX-40（CD134，TNFRSF4肿瘤坏死因子受体超家族，成员4）为炎症部位激活的T细胞中出现的协同刺激分子，可调节抗原特异性T细胞增殖，存活和细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ生成。OX40的免疫活性信号通路使得其成为了新型的免疫治疗靶点。
临床前研究表明，OX40拮抗剂在治疗黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、结肠癌、肉瘤、肾癌和前列腺癌中具有抗肿瘤活性。
在I期临床研究中，实体瘤患者采用三种不同剂量的同一种鼠类抗人OX40抗体进行一轮治疗。发现毒性尚可忍受，包括乏力、发热/寒战、一过性淋巴细胞减少、和轻度皮疹。31例患者中的12例出现肿瘤缩小，体液免疫和细胞免疫都得到了增强。可检测到高水平的人抗小鼠抗体，因此，人OX40拮抗剂的研发变得很有必要。
对乳腺癌和前列腺癌患者采用OX40拮抗剂联合放疗的治疗方法的研究正在进行中。
3.2 CD137
CD137（4-1BB）是肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族中的诱导型T细胞表面分子。与其受体CD137L相结合，协同刺激CD4和CD8细胞。Treg、激活的NK细胞均表达CD137。Urelumab（BMS663513）为CD137的拮抗剂，已经用于I/II期临床试验，均发现尽管具有严重的肝毒性，但仍具有抗肿瘤活性。
尽管如此，应用Urelumab治疗NSCLC的试验已被终止。
3.3 GITR
糖皮质激素样诱导的TNF受体（GITR）为TNF受体超家族的一员。GITR作为CD4+和CD8+幼稚T细胞的协同刺激分子，会引起T细胞增殖和提升效应器的功能。GITR可见于Treg、效应T细胞、B细胞、NK细胞和激活的树突状细胞。TRX518，单克隆抗体GITR拮抗剂，目前正处于I期临床研究中。
3.4 CD40，CD28，CD27和ICOS
CD40A是肿瘤坏死因子超家族的医院，参与细胞分化，存活和凋亡。临床前期研究结果表明，抗CD40抗体可能能够抑制肿瘤生长和转移。CD27是另一种T细胞的刺激性受体，同样起着拮抗作用，目前正处于I期临床研究中。诱导型T细胞协同刺激因子（ICOS）为与CD28相关的T细胞协同刺激因子。
TGN1412，为CD28的抗体，因其毒性过强，所有该类药物的研究均被终止。
4. 联合治疗
联合治疗的目的在于同时瞄准多种肿瘤发生通路进行抗肿瘤治疗。包括联用不同作用机制和不同毒理特性的细胞毒性化疗药物来杀死肿瘤细胞。NSCLC的一线治疗药物为铂类。随着随着分子靶向治疗NSCLC的出现，联合用药走进了人们的视野。
某些靶向治疗和化疗联用联合用药能使患者获益，某些联合用药却会对患者带来巨大伤害。某些单药被认为有治疗效果，但联合起来使用却并不能改善患者的生存率，这些现象仍有待进一步的研究进行明确。
CTL4抑制剂与化疗药物联用的III期临床研究的关注重点为ipilimumab在和紫杉醇以及卡铂联用治疗鳞癌NSCLC中的作用。Nivolumab和Ipilimumab与KIR抑制剂联用，nivolumab与多种化疗药物和靶向治疗药物联用均已在前文描述。
不同免疫抑制剂的联用同样引起了大家的兴趣，并且已经处于测试阶段。在采用自体肿瘤细胞合成的分泌GM-CSF进行疫苗接种后CTLA4被阻断，表明治疗晚期黑色素瘤的抗肿瘤免疫治疗可不伴有明显的毒性。在临床前的模型中，采用PD1和CTLA4抗体进行多种免疫检查点阻断，能使T细胞的反应性增强，减少T细胞失能。
抗肿瘤治疗中，免疫治疗的时机仍有待研究。在一项II期临床研究中延迟应用ipilimumab较早期应用疗效更佳，但原因尚不明确。
5.预测生物标记物
预测性的生物标记物是很有必要的，因为在某些特定人群中，免疫调节物会引起双向调节。许多CTLA4的生物标记物都已在临床应用。淋巴细胞绝对计数的升高被认为与临床疗效相关。有研究表明ipilimumab疗效和CD4+T细胞表达高水平ICOS呈正相关。
Ipilimumab治疗后HLA-DR在CD4T细胞中表达增多。肿瘤浸润淋巴细胞与ipilimumab疗效相关， Forkhead box P3（FOXP3）-阳性和indoleamine2,3-dioxygenase阳性患者则对CTLA4阻断疗法反应良好。
PD-L1在不同肿瘤微环境中的表达存在差异，并且不会在某一时间点停止表达。PD-L1的表达与肿瘤微环境中IFN-γ的出现相关，这一点可以解释为何PD-L1的表达不能作为nivolumab疗效的预测生物标记物。在肿瘤治疗领域，预测性生物标记物的研究仍处于起步阶段。
6.肿瘤对免疫制剂反应的评估
现在被广泛接受的用于评估抗肿瘤治疗疗效的方法为RECIST标准。但是，依据RECIST，肿瘤体积增大30%或更多，即使是在治疗早期，都被认为是疾病进展。但免疫治疗的治疗反应在RECIST所定义的疾病进展后才得以显现。尽管肿瘤进展明显，患者仍能从免疫治疗中获得临床疗效，持续的SD则表明疗效的维持。
基于上述说法，免疫相关的应答标准应运而生。免疫相关无进展生存（irPFS）能够说明尽管肿瘤显著增大，但疗效依然得以维持。这一称之为“假性进展”的现象可能是由于癌周的淋巴细胞浸润或迟发的免疫应答所致。
7.结论
对免疫系统中肿瘤监控的认识增加有助于新的免疫制剂的研发。尤其是目前广泛认为肿瘤能够通过使协同抑制或检查点信号分子失调而侵入免疫系统。早期的对实体瘤，如NSCLC，中的CTLA4，PD-1和PD-L1抑制物等免疫检查点调节物的研究前景光明，会为NSCLC的治疗带来新的曙光。
未来的挑战包括不同免疫治疗药物间的联合应用，或免疫治疗药物与细胞毒性化疗药物的联合应用，分子靶向治疗和放疗的联合应用，以及其在疾病早期的应用疗效和预测性生物标记物的发现。