工业国家癌症导致的死亡中，结直肠癌排第三位。发达国家结直肠癌发生率正在下降，而发展中国家，结直肠癌发生率仍在迅速提高。腺瘤-癌症转变的遗传学改变发现24年了，基因组、表观基因组的研究方法和转基因小鼠模型的建立，对结直肠癌发生的本质有了深刻的认识，揭示了结直肠癌出人意料的复杂性。
确实存在的结直肠癌异质性要求癌症治疗应当个体化；肿瘤间的异质性更加依赖基因的表达和甲基化，据此还出现了新结直肠癌分类方法，这可能深刻影响未来的临床实践活动。对同一肿瘤内异质性的理解正在不断提高。
20年前发现结直肠癌异质性，不同肿瘤中多个肿瘤细胞克隆，携带不同遗传学突变；最近发现即使是遗传学一致的结直肠癌细胞也存在同一克隆中的异质性，主要表现为增殖能力和对治疗耐受性的不同。这表明表观遗传学因素对肿瘤增殖和耐药等功能性特征起到至关重要 的作用。
结直肠癌干细胞的发现进一步证实了肿瘤内的异质性，这种异质性的鉴定主要通过肿瘤细胞上不成熟细胞标志的表达、自我更新能力的增加、耐药和转移能力等特征的不同进行。最初认为结直肠癌干细胞是一群表型明确和分子特征明确的细胞，然而新证据表明结直肠癌干细胞是一群动态发展的细胞，由遗传学、表观遗传学和微环 境因素共同塑造形成。
随着对干细胞多能性认识的不断提高，需要对结直肠癌干细胞重新认识。多能性不仅仅是细胞内部特征，还高度依赖环境因素。传统上通常相反的作用，如随机或是决定性的、遗传性或是表观遗传性的、细胞内源性的或是外部因素，这些因素共同形成多能性，最终导致同一肿瘤内细胞的功能多样性（图1）。
图1. 肿瘤异质性情况下的结直肠癌干细胞 肿瘤异质性由遗传学、表观遗传学和微环境因素共同驱动，最终导致个体的、克隆的和克隆内的多样性。
意大利的Ann Zeuner博士在Cell Stem Cell杂志上发表了一 篇综述，重点阐述结直肠癌干细胞概念的进展，对结直肠癌干细胞理论产生颠覆性影响的试验-主要涉及结直肠癌干细胞的演化，表型和功能以及这些发现与临床的 相关性。
现已形成干细胞特征假说：结直肠癌肿瘤的发生发展与干细胞池的变化密切相关。干细胞特征对结直肠癌病人具有高度预后作用，揭示干细胞驱动肿瘤进展 的机制有助于对此过程进行干预，改善结直肠癌的治疗。
成人肠道：复杂的微环境，由干细胞维持
结直肠癌干细胞不一定衍生于正常肠道干细胞，但是二者共享一些基础信号途径，所以理解肠道干细胞调节机制，有助于理解恶性肿瘤干细胞生物学。然而大部分研究只着重小肠肠道干细胞生物学，对结肠干细胞了解较少。传统上认为小肠陷窝是典型肠道干细胞来源，用于鉴定不同功能的肠道干细胞群。
目前有两群肠道干细胞，一群是+4细胞，主要表达BMI1、HOPX、TERT和LRIG1，另一群是小肠陷窝基底柱细胞，高表达LGR5。它们都有自我更新能力，可以分化为各种肠道上皮细胞，满足真正干细胞标准。
尽管两个肠道干细胞群能够双向转化，起初仍认为代表不同干细胞群，具有不同功能活性。增殖的LGR5+细胞与肠道止血有关，静止BMI1+细胞是预留干细胞池，能再生LGR5+细胞。研究发现LGR5+细胞表达包括BMI1在内的+4细胞标志，引发疑问：2种肠道干细胞群是否真的不同？
接下来主要采用谱系追踪技术，鉴别肠道干细胞池本质特征。发现活化的循环中LGR5+细胞产生一群存在时间很短的静止潘氏细胞前体，表达LGR5和+4细胞标志，损伤时获得功能性干细胞特征。一群LGR5_分泌性前体细胞，特征表达Notch配体DLL1，也在损伤时产生肠道干细胞群。谱系追踪实验是肠道干细胞研究主要手段。
事实上这种方法最近用于定义陷窝和腺瘤中功能干细胞的数量，鉴定小肠和结肠中DCLK1+静止细胞亚群。研究新技术还包括采用遗传学或是双LGR5-GFP标志的肠道干细胞动态图像；Ki67RFP转基因小鼠用于研究干细胞在肠道内动态变化，阐明肠道干细胞异质性。
结肠与小肠陷窝在结构与细胞组成上有几点不同：结肠陷窝不在粘膜表面凸出形成绒毛；不包含潘氏细胞、+4细胞或是BMI1+细胞。
通常认为结肠干细胞LGR5+ 或EphB2high，移植小鼠结肠能产生完全自我更新的陷窝。通过Notch信号或LRIG1表达的增高，检测并鉴定结肠陷窝中的慢周期干细胞，它是DCLK1+丛细胞的一个亚群。需要进一步鉴定结肠干细胞转化机制，特别是陷窝内有大量细菌时，微生物群改变所致的潜在致瘤功能。
肠道干细胞和结直肠癌起源
结直肠癌细胞起源可能有助于肿瘤间异质性产生，对肿瘤特征（不同表型和临床特征）鉴定很重要，特征的形成需要WNT途径。表达LGR5、BMI或CD133的肠道干细胞特异性活化ß-catenin途径导致腺瘤发生，这表明肠道干细胞是结直肠癌最常见的起源细胞。
然而小鼠模型和结直肠癌病人肿瘤发生发展存在不同，意味着描述结直肠癌起源时需要考虑更多因素。首先，大部分结直肠癌遗传小鼠模型虽然导致腺瘤形成，但较少进展为癌；第二，结直肠癌遗传小鼠模型中腺瘤形成发生在小肠，而人类则主要发生在结肠；第三，人类结直肠癌发生发展受环境因素影响极大，例如小鼠模型中通常不存在慢性炎症。
结直肠癌发生发展极其复杂，很难完全再现于小鼠模型，但是结直肠癌最常见遗传学突变(APC、P53和KRAS)影响干细胞动态变化致肿瘤形成方面取得进步。正常陷窝中干细胞持续以随机方式相互替代，癌性突变使某一克隆获得优势，野生型干细胞较少能代替此优势克隆。但突变干细胞并不是完全不变，仍可随机被野生型细胞代替，这使突变累积过程变得很复杂。
观察到的一些现象支持该模式：腺瘤看起来是一群可以进行有丝分裂的细胞群，在某个偶发事件触发下启动侵袭性亚克隆细胞快速生长，导致癌症发生发展。陷窝内正常与突变干细胞之间的竞争受炎症影响：P53突变克隆正常情况下不比野生型细胞更具生长优势，但存在炎症的肠道更容易生长。
这些现象清楚显示遗传学和环境因素在结直肠癌发生中的重要作用，通过影响干细胞克隆优势程度实现，这种优势在肿瘤进展中不断壮大，产生更具竞争性的结直肠癌。肿瘤生长早期，竞争发生在正常细胞与恶性细胞间，进展期竞争发生在恶性肿瘤细胞克隆间，意味着遗传学突变和环境压力双重作用下更具侵袭性的细胞克隆会渐次出现。
在进展期肿瘤高度竞争的微环境中，癌细胞增加生存机会不仅仅要提高增殖能力，还要通过累积机制增加遗传飘变。这个过程中，因为肿瘤细胞超常的竞争力和异乎寻常的能力本身，转移性结直肠癌可能出现在进展肿瘤顶端。
值得注意的是肿瘤进展后都会有癌症干细胞减少过程，原因要么是接受治疗得到缓解，要么是肿瘤治疗无效。这一现象是由结直肠癌“overshoot”所致，即无法控制的肿瘤不断扩增进而导致肿瘤的最终破坏，这与某个生态圈内人口远远超过环境所能承担范围时发生的事情类似（图2）。
图2. 结直肠癌内的肿瘤进化与癌症干细胞扩增 结直肠癌干细胞扩增能力在肿瘤发展过程中提高，这是遗传学突变和环境压力共同作用结果。进展期癌症干细胞不仅仅是克隆增加竞争能力而且还增加远处转移定植能力。这种状态是非常必要，因为这种状态之后常常会因为治疗而导致癌症干细胞群的灭绝。
最近，肠道干细胞是结直肠癌细胞起源的概念受到挑战。研究显示结直肠癌可以起源于更加分化的细胞，主要由NF-kB结构活化所致。还有结果显示APC去 除和化学诱导炎症共同作用下，结直肠癌可以来自分化的静止DCLK1阳性丛细胞亚群。总之研究显示肿瘤既能起源于干细胞也可以源于非干细胞，这使结直肠癌细胞来源变化莫测。
结直肠癌干细胞的表型与功能特征
第一次分离人类结直肠癌干细胞基于CD133表达，并在小鼠体内诱导肿瘤形成而确证。寻找结直肠癌干细胞其它表面标志从未停歇，试图发现结直肠癌干细胞特异性标志利于发展新的预后评估与治疗工具。目前已描述几个结直肠癌干细胞表型，干细胞表面标志在正常肠道干细胞也表达，这些标志作为治疗靶点很困难。
记载的用于鉴定结直肠癌干细胞的标志包括EphB2high 、EpCAMhigh/CD44+/CD166+ 、ALDH+ 、LGR5+ 和CD44v6+。最近提出DCLK1激酶的表达可以作为特异性标志，它不存在正常肠道干细胞，遗憾的是这个标志细胞内表达，限制了作为潜在治疗靶点的可能。
结直肠癌干细胞鉴定方面仍有许多问题。首先结直肠癌干细胞标志的一致性值得深入研究，因为干细胞表型本身是不稳定的。事实证实LGR5阳性或是阴性结直肠癌干细胞群在化疗作用下能够相互转化；肿瘤相关细胞产生的细胞因子能诱导干细胞自我更新能力增加；能使暂时扩增的前体细胞重新编程转向癌症干细胞发展。
表达癌症干细胞标志的细胞比例可能因肿瘤分期、肿瘤类型或治疗时间不同而变化，最终因一系列微环境和很难预测的个体因素的共同作用而不同。所以动态环境下，癌症干细胞在肿瘤进展时数量和表型会发生变化，癌症干细胞标志应当看作一个相对变量，与环境因素相关，不应当看作肿瘤普遍共有特征。
除表型标志，鉴定癌症干细胞可以通过分子和/或功能特征实现。结直肠癌干细胞存在过度活化ß-catenin途径，该途径活化在体内产生一系列肿瘤。另一个干细胞功能特征是自我更新，此过程依赖转录调节因ID1和ID3。最近认为转录调节因子BMI1也是结直肠癌干细胞自我更新中的重要角色，该转录因子的抑制功使干细胞肿瘤生长特征削弱或缺失。
有关结直肠癌干细胞功能的重要信息通过分子追踪研究获得，这种方法能监控体内环境下干细胞的行为，能够明确干细胞功能特征。该研究证实存在多种类型结直肠癌干细胞，在维持肿瘤和肿瘤转移中发挥不同的作用，多种类型的结直肠癌干细胞也是细胞异质性的重要原因，同时也有助于结直肠癌中形成不同的细胞等级。
结肠癌干细胞：难以捉摸的还是可塑的？
充分证据表明干细胞性是一种动态的状态。这种动态与表观遗传学状态模式相关，该模式与不同的增殖潜能、分化潜能和凋亡潜能有关，这就产生了干细胞群中功能的可变性，从而对环境因素的高适应性。
干细胞动态基础是可塑性，这里指细胞在不同功能状态间转化的能力，功能状态包括静止与增殖、药物敏感与拮抗、对称和 不对称分裂、表皮与干细胞相互转化以及干细胞与非干细胞状态的转化。癌症干细胞遵循如下原则：在耐药、无症状分裂和分化状态方面具有可塑性。
实体瘤如黑色素瘤、乳腺癌和结直肠癌中，癌症干细胞与非干细胞之间确实存在转化，特别是增强的NF-kB信号或是肿瘤相关细胞产生的细胞因子刺激WNT活化 增强时，结直肠癌可以起源于去分化的前体细胞。
结直肠癌干细胞可塑性是否只依赖外源性因子或随机依赖某些因素，这些因素在乳癌细胞株癌症干细胞和非干细胞间的转化中起到重要作用。事实上，基因表达的随机变化增加细胞对微环境变化的适应性，所以结直肠癌干细胞可塑性可能由随机因素与微环境变化联合所致，导致群体水平的一种适应性变化。
同正常干细胞相比，恶性可塑性可能代表了结直肠癌干细胞的一种能力，试图增加自己的适应潜能。正常干细胞对外界变化的反应是通过组织再生恢复机体稳态，癌症干细胞是提高自身数量并采用更具侵袭性的表型。这种行为以往曾经提出过并用数学方法解释过。
癌症干细胞化放疗后增加，不仅结直肠癌，其它肿瘤也如此。静止癌症干细胞能逃离细胞毒治疗，致肿瘤干细胞相对增加。多个周期靶向增殖癌症干细胞的化疗后，可能会促进癌症干细胞增殖和自我更新。靶向治疗能部分或全部去除癌症干细胞池，但可能要面对非干细胞向癌症干细胞转化问题。在极端严重情况下，靶向治疗可能导致更具侵袭性肿瘤的复苏。
在治疗中和治疗后，微环境信号压力或是耐药遗传学突变会产生具有新的功能特征的癌症干细胞。癌症干细胞和短暂扩增前体细胞间相互转化，这二种情况都可以随机产生更具侵袭性的克隆。
应当把癌症干细胞模型和随机模型都认作是癌症前体细胞池，癌症前体细胞池是癌症干细胞的来源。虽然结直肠癌细胞前体不能自 我更新也不能迁移到转移位点，但在某些微环境下能转化成为癌症干细胞，这样形成微小病变和转移灶。
为了避免治疗后癌症干细胞再生，一种可能的方法是联合癌症干细胞靶向治疗和抑制微环境或是抑制重新编程短暂扩增前体细胞表观遗传学的药物。干扰肿瘤细胞可塑性可能提供新方法用于支撑传统和靶向抗癌药物的活性。
调节结直肠癌干细胞的信号途径
正常肠道干细胞信号途径的认识近年已取得很大进步，而结直肠癌干细胞中信号途径异常作用的研究仍处于起步阶段。这里我们将着重3个在结直肠癌干细胞调节中非常关键的途径，包括WNT途径、BMP途径和Notch途径。
WNT生长因子在调节正常和恶性干细胞中作用突出。90%结直肠癌存在APC或WNT/ß-catenin突变，致WNT靶基因转录增加。但ß-catenin异常不足以产生结直肠癌，其它突变、表观遗传学沉默、微环境信号或是交叉途径协助增高核ß-catenin水平致瘤生成。WNT/ß-cateni突变结直肠肿瘤显示不同水平WNT活化，只有高水平WNT活化才显示ß-catenin核定位并拥有癌症干细胞特征。
由于APC突变出现ß-catenin异常调节的细胞里，附加遗传学突变有助于WNT/ß-catenin途径活性更高。在APC缺失遗传背景下，KRAS突变使WNT/ß-catenin途径活性更高，细胞具有癌症干细胞表型、转移潜能增加。此外WNT/ß-catenin活化受Notch、Hedgehog、PI3K和BMP等途径调节，致癌症干细胞库微调。
在结直肠癌中，上述途径如何与APC缺失协作驱动干细胞扩增的例子最近已有报道，该研究中显示活性氧可以把GTPase Rac1 和NF-kB途径连接起来，启动结肠肿瘤发生。在陷窝基底部发现活性氧水平增高可能在调节肠道干细胞和癌症干细胞中发挥重要作用，但关于这方面的内容知之 甚少。
最近关于癌症干细胞调节新线索已有报道，研究显示WNT和Hippo途径的交叉点中，后者是控制器官大小和力传导的关键调节因子，Hippo的转导子YAP/TAZ是ß-catenin胞浆损坏复合物的必需成分，YAP/TAZ易位进入胞核对WNT/ß-catenin信号是必需的。
YAP/TAZ调节肠道干细胞作用复杂：YAP既作用原癌基因也作用抑癌基因，结直肠癌干细胞中YAP/TAZ作用还不清楚，但已证实TAZ赋予癌症干细胞特征以及乳癌化疗耐药特征。YAP/TAZ在稳态下不是必需，但在强烈肠道增殖中作用重要，表明YAP/TAZ可能参与结直肠癌干细胞发展。
陷窝基底部WNT信号活跃，支撑肠道干细胞增殖；TGF-ß/BMP信号主要位于陷窝开口末端，促进细胞分化和凋亡，部分抵消WNT/ß-catenin作用。正常结肠此行为是高度区间化和组织化的，WNT/ß-catenin 和TGF-ß途径在结直肠癌中发生变化，协同促进结直肠癌发生。
TGF-ß超家族成员和BMPs在正常和肿瘤性肠道干细胞调节中发挥巨大作用。BMPR1敲除小鼠由于增加WNT信号表达和干细胞增殖而多发肠道息肉；BMP家族中的BMP2和BMP4在结直肠癌干细胞中特别重要，促进癌症干细胞分化并拮抗WNT/ß-catenin信号；转录因子GATA6是恶生克隆中WNT和BMP途径关键调节因子。
腺瘤中分级情况与结直肠癌很相似，GATA6直接调节LGR5表达，APC缺乏时敲除该基因能抑制结肠肿瘤发生。GATA6与ß-catenin/TCF4竞争性结合BMP4调节区域抑制BMP基因表达、降低BMP信号、促进癌症干细胞扩增和自我更新。这些发现提供了BMP途径如何抑制癌症干细胞自我更新，揭示了WNT和BMP途径的关联，助于解读结直肠癌干细胞调节间的相互作用。
Notch也在控制结直肠癌干细胞中发挥作用。Notch信号是正常小鼠肠道干细胞稳态所必需的。抑制癌症Notch途径，特别是DLL4，显示减少癌症干细胞频度并增加化疗敏感性。Notch信号水平在结直肠癌干细胞中特别高，有助于阻止凋亡并维持细胞未分化状态。
最近研究显示Notch途径通过microRNA介导的环路控制对称性与非对称性细胞的分裂率，影响结直肠癌干细胞。事实证实不同水平miR-34a通过靶向Notch1决定结直肠癌干细胞分裂模式。早期结直肠癌干细胞高表达miR-34，捕获Notch1 mRNA，平衡非对称和对称细胞分裂，晚期癌症干细胞缺少该调节，以自我更新为主要分裂方式。
在同一问题上的系列研究显示存在一个信号通路，通路中包括 Snail、miR-146a和Notch 抑制子Numb，通路微调WNT信号，WNT信号反过来调节自我更新式的分裂和干细胞扩增。总之结直肠癌干细胞信号通路的控制非常复杂。
结直肠癌的动态微环境
微环境对癌症细胞的命运和功能影响巨大。在一种极端情况下，微环境甚至能重新编程癌细胞使其正常化，这一现象源自于一项观察结果，将胚胎癌细胞注入小鼠皮下时产生畸胎癌，而注入胚泡时产生正常嵌合小鼠。
结直肠癌中许多事实支持微环境控制癌细胞，如慢性炎症利于肿瘤发展，调节癌症干细胞池。肿瘤微环境包括非恶性细胞如上皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞以及非细胞的基质蛋白聚糖、透明质酸和纤维成分。肿瘤相关细胞与细胞外基质形成支撑肿瘤的网络或基质。可预测的是基质不是稳定的支架，在肿瘤进展中经历动态变化，在肿瘤生长和耐药方面发挥作用。
正常小肠中干细胞代表是潘氏细胞，结肠为cKIT+杯状细胞。负责干细胞维护的特定微环境就是干细胞小环境，结直肠癌陷窝破坏，癌症干细胞不能依赖传统微环境，只能依赖混乱的多种细胞构成的环境，该环境不能为细胞提供常规信号。已经证实结直肠癌干细胞微环境提供的信号在确定癌症干细胞状态中发挥重要作用，负责诱导癌症干细胞表型与功能（图3）。
图3.正常结肠和结直肠癌中干细胞微环境模式图
Vermeulen等的工作证实HGF由癌症相关成纤维细胞释放，活化结直肠癌干细胞中ß-catenin依赖的转录和自我更新。HGF还能诱导癌症干细胞表型转向更为分化的肿瘤细胞，为癌症干细胞可塑性提供有力证据。
更多发现支持微环境决定癌症干细胞特征的概念，许多功能因子由肿瘤相关细胞释放。内皮细胞产生Notch配体DLL1、活化Notch信号、促进癌干细胞表型变化。结直肠癌干细胞存在于人类结肠肿瘤血管周围，与恶性胶质瘤相似。间充质细胞是肿瘤基质细胞，分泌前列腺素E2、诱导ß-catenin活化、促癌症干细胞形成细胞因子，协助癌症干细胞表型变化。
最近研究显示CAFs通过释放HGF、OPN和 SDF1促进结直肠癌前体细胞重新编程转化为癌症干细胞。免疫细胞和CD4+ T细胞能分泌IL-22和活化DOT1L甲基转移酶影响结直肠癌干细胞自我更新，DOT1L甲基转移酶负责干细胞相关基因的转录。
与癌症干细胞微环境动态变化一致的是CAFs能够在化疗时分泌包括IL-17A在内的特殊细胞因子和化学因子，增加结直肠癌干细胞自我更新和侵袭能力，后者显示出化疗诱导肿瘤微环境重塑，促进癌症干细胞群向更侵袭方向进展。今后研究会着力于微环境对癌症干细胞动态行为与功能的影响，这可能会暴露癌症干细胞的生存弱点，发现治疗靶点。
干细胞性与转移：一个硬币的二面？
联接癌症干细胞与转移的线索多且有说服力，初期证据是只有启动肿瘤发生发展的癌细胞才能在远处形成新肿瘤。一份初期报告表明表达CD26的癌症干细胞亚群负责结直肠癌远处转移。
其后提出假说：转移细胞和癌症干细胞之间存在交叉。2项研究分析了慢病毒标记的肿瘤细胞克隆，显示转移灶来自于原发肿瘤的细胞亚群，这群细胞是静止的，对化疗耐药，具有长期自我更新能力，拥有典型癌症干细胞特征。
一个相关问题是结直肠癌干细胞定植不同组织器官的潜能，这可能是随机分布或是分子驱动的过程。最近报道显示只有癌症干细胞表达CD110时才能定植于肝脏，表达CDCP1与肺转移相关。肝细胞产生的促血小板生成素增加CD110+癌症干细胞自我更新能力并允许癌细胞外侵入肝实质内，而CDCP1+癌症干细胞更喜欢定植于肺微血管内皮。
很明显，CD110+ 和 CDCP1+细胞属于CD133+细胞群并拥有癌症干细胞的功能特征。尽管CD110和CDCP1与病人结果负相关，有可能用于预后评估，但驱动分化表达和转移倾向的遗传学和表观遗传学具体机制仍不清楚。
直觉上看启动转移的应该是癌症干细胞，但不清楚是否所有结直肠癌干细胞都能形成转移。一直认为获得特别的遗传学突变应当与癌症干细胞出现转移潜能相关，但原发结直肠癌和与之对应的转移灶相比，未发现特异突变与转移特征相匹配。
另一方面，不断增加的证据表明表观遗传学调节因子或是基因突变主要用于控制代谢途径利于癌细胞能力增加适应环境压力变化。所以原发癌的遗传学和表观遗传学及微环境因素共同形成了单个肿瘤的转移特征。
TGF-ß显示在转移肿瘤细胞和结直肠癌微环境中作用重要。TGF-ß抑制肿瘤初始转化阶段，但在肿瘤进展阶段起到癌基因作用。这种转化看起来与附加突变有关，如P53或SMAD4突变。
进展期肿瘤TGF-ß水平增加同预后差相关，因为肿瘤细胞与基质细胞交叉后诱导活化转移前程序，致转移癌细胞生存能力和组织定植能力增加。而且启动转移的结直肠癌细胞具有增加环境TGF-ß的能力，通过分泌TGF-ß或招募分泌TGF-ß的细胞如巨噬细胞、CAFs或是血小板。
结直肠癌中启动转移的细胞表达CD44v6，是MET受体。BMPs能减少转移性结直肠癌干细胞形成，诱导癌症干细胞分化失去CD44v6表达和转移潜能。相反，活化PI3K、增加ß-catenin活性的细胞因子如HGF、SDF1和OPN，能使非转移性前体细胞成为转移性癌症干细胞。
与此一致的临床数据显示需要PI3K和ß-catenin联合活化才能形成转移性结直肠癌。结构性的或是重新编程的结直肠癌干细胞表达CD44v6，显示上皮-间充质细胞转化基因有助于细胞活性、侵袭性和转移潜能改变。
BMPs和 PI3K/ß-catenin之间的拮抗可以因为SMAD4突变而改变，活化NCI60细胞株中ROCK途径，可以将BMPs肿瘤抑制活性转化为转移驱动信号。然而我们发现BMP4促进原发结直肠癌干细胞分化与SMAD4状态无关，需要进一步研究BMP信号和SMAD4突变在细胞中的作用。
现在认为homeobox的转录因子PROX1在转移性癌症干细胞扩增中作用重要，PROX1有助于结直肠癌干细胞通过持续自吞噬作用增加不利微环境适应能力，自吞噬以往认为是结直肠癌细胞生存的必要条件。
结直肠癌干细胞与肿瘤预后、治疗的潜在相关性
最近对结直肠癌干细胞分子特征的研究指出，癌症干细胞相关基因和预后强烈相关，和乳腺及其它肿瘤一样，对结直肠癌病人也有预测复发作用。但目前癌症干细胞表面标志的表达是否可以用作预测病人仍有争论。
一项meta研究分析了15项研究，发现高CD133表达是总生存和无病生存独立预后标志，LGR5可能与预后无关。另外癌症干细胞相关基因LGR5、CD44和ALDH1A1多态性可以用来定义部分II期和III期病人，其特征是复发时间明显缩短。
癌症干细胞可能是非常有效的用于治疗结直肠癌的靶点。很多报告显示结直肠癌干细胞具有内源性耐药倾向，而且在传统治疗后肿瘤再生和复发上发挥重要作用。直接靶向癌症干细胞的治疗可以通过干扰重要的抗凋亡和代谢途径，或是通过活化分化途径，或是作用于保护性微环境抑制自我更新等方面实现。
最近的研究中涉及几个抗癌症干细胞药物，其中一些正向临床应用努力。既往研究中阻滞IL-4自分泌，通过降低抗凋亡蛋白水平，使癌症干细胞对药物诱导死亡更敏感。抑制Notch途径能减少癌症干细胞频度。Polo样激酶1是激酶抑制剂靶点，该靶点是增殖的结直肠癌干细胞生存所必需的。
最近靶向线粒体的药物也显示增加化疗有效性并靶向静止的结直肠癌干细胞，通常去除干细胞是特别困难的。还有临床数据显示WNT靶向药物很有前景，抗癌症干细胞活性与BMPs相似，而BMPs是内源和外源性结直肠癌干细胞抑制剂，增加化疗的抗肿瘤活性，减少致癌细胞因子大量进入微环境。
总之越来越明确，结直肠癌中癌症干细胞数量是可调的，主要通过前癌症干细胞和抗癌症干细胞因子的比例实现（图4）。现在大多数临床干预实验都在出现转移的病人中进行，目的是暂时控制肿瘤进展。然而随着对结直肠癌生物特性认识越来越深入，现已存在几种治疗选择。
图4.前癌症干细胞和抗癌症干细胞分子间的平衡影响疾病结果 前癌症干细胞的细胞因子由肿瘤微环境产生，并增加癌症干细胞池，而内外源性抗癌症干细胞分子则减少癌症干细胞数量，强制细胞向下分化。化疗对促进肿瘤发生的微环境几乎无效，因此需要能够靶向癌症干细胞自我更新与生存的治疗。
癌症干细胞的靶向治疗可能是最有效控制癌症干细胞脱离肿瘤的手段，使肿瘤干细胞不能获得保护性微环境而对联合治疗更敏感。实际上辅助治疗中部分靶向弥散癌症干细胞的治疗只是经验性应用。虽然无证据表明能有效靶向癌症干细胞，但辅助化疗极可能杀死因手术弥散的癌症干细胞。这就解释了II 期和III期病人辅助化疗可以明显增加治愈优势。
在适当的临床情况下靶向癌症干细胞的例证就是PI3K/AKT途径。尽管以往临床研究显示PI3K/mTOR抑制剂单药用于进展期病人有效率很低，但同样的治疗如果在恰当情况下可能产生更大获益。
对过度表达ß-catenin 和FOXO3a的细胞株进行的实验表明，这2个基因上调的肿瘤中，PI3K抑制作用是促进肿瘤转移而不是抑制肿瘤。然而我们接下来发现结直肠癌干细胞ß-catenin 和PI3K/AKT途径结构性活化，体外实验中PI3K抑制可以导致其死亡。我们还观察到小鼠具有原发肿瘤时如果采用PI3K抑制治疗能大量减少转移形成。
我们的数据与最近的临床观察一致，显示结直肠癌中ß-catenin的转移活性依赖PI3K活化。这样同标准治疗相比，有可能抗癌症干细胞药物和化疗联合治疗更有效，特别是在辅助治疗中加入靶向弥散的癌症干细胞治疗（图5）。
图5.结直肠癌干细胞对临床治疗的影响
癌症干细胞研究发现转化进入临床实践中时，需要合适的工具评估靶向癌症干细胞治疗的有效性。不论是人类还是小鼠，减小肿瘤体积并不是减少癌症干细胞池治疗有效的评估标准，相反可能是更具侵袭性的癌症干细胞驱动肿瘤发展的前奏。
传统的I/II期临床试验结构导致患者都是进展转移性的或是经过多次治疗的病人，也许并不适合用于研究靶向癌症干细胞药物的活性。事实上进展期肿瘤由癌症干细胞形成的等级结构有可能消失，肿瘤微环境的保护作用可能被靶向药物严重破坏。
还需要合适的方法评估癌症干细胞群治疗的有效性，这些方法可能包括评估癌症干细胞表型特征的检测技术，表型特征应当是容易监控并适合评估循环中的癌症干细胞。应当注意癌症干细胞标志随时间和病人变化，可能依赖环境因素，并且同肿瘤细胞起源、突变特征和类型相关。所以应当建立癌症干细胞功能的临床检查，评估针对癌症干细胞治疗的有效性。
一个潜在癌症干细胞相关检查是评估IV期病人是否形成新转移，特别是肝转移切除和癌症干细胞靶向治疗明显获益的病人。在恰当情况下使用靶向癌症干细胞治疗是值得进一步探讨的问题。随着对癌症干细胞生物特性理解日益加深，癌症干细胞治疗临床试验也会迅速发展。
临床前模型的限制：现在的证据与缺陷
用于分离、扩增结直肠癌干细胞的方法强烈影响对细胞群的认识，因此应尽可能阐明不同培养方法的限制与可能的偏倚，这一点对结直肠癌干细胞研究特别重要，因为结直肠癌干细胞体内体外相对都容易扩增。
通常使用的体外扩增结直肠癌干细胞的代表性方法是细胞球状培养MSCs和类器官OCs，体内代表性方法是异种移植。异种移植可以通过小鼠与分离的癌症干细胞共同培养，获得皮下或结肠肿瘤，或是皮下移植部分原发肿瘤从而产生病人来源的异种移植物（PDXs）。
细胞球状培养（MSCs）来自原发或是转移肿瘤，广泛用于分离和扩增结直肠癌干细胞。MSCs可以方便获取大量结直肠癌干细胞用于体外实验、储存和体内实验。然而很多科学家更愿意使用传统细胞株代替原始标本用作MSCs。细胞株经历了多次体外传代， 同病人体内生长肿瘤极有可能完全不同。
很多数据都是采用这种模型产生，因此可能包括很多伪象导致结论不可靠。而且MSCs生长可能受特异性驱动突变影响，这种突变可能依赖不同研究者所采用的不同培养环境。成功的从手术标本中分离结直肠癌干细胞的有效性相对较低，大约30%左右，且哪些细胞利于选择性产生MSC不清楚。
体外产生3D陷窝样结构称作类器官，已经用其尝试正常和肿瘤性肠道干细胞生长。最近研究显示类器官可用于癌基因突变研究，有望成为研究结直肠癌发展的遗传学改变模型，当然也存在一些限制。
KRAS和P53突变与类器官的发展相关，类器官与MSCs相似包括小量干细胞。通过2个小分子丙戊酸和GSK抑制剂， 正常小肠细胞培养中选择性扩增干细胞已获得成功。在此种情况下LGR5+细胞可以维持球状克隆生长保持高纯度和自我更新能力。
皮下癌症干细胞衍生的肿瘤异种移植广泛用于临床前检测新的治疗药物。目前原位移植癌症干细胞也可行，在出现肺和肝转移方面优势明显。PDXs平台用于临床前药物检测，保留个体多样性和遗传学异质性，还能出现转处转移。PDX可能受特异突变影响，因为一些研究者通过KRAS突变肿瘤获得大量PDX。
对于生长的结直肠癌肿瘤而言，体内方法主要缺陷是肿瘤周围的异基因信号网络，因为小鼠和人的微环境可能会对癌症干细胞行为有不同影响。缺少淋巴细胞和有关细胞因子可能减少这种临床前模型的预测能力，若采用转基因小鼠模拟人类疾病作为实验补充可能会使模型说服力更强。
按照功能分析和表面标志鉴定癌症干细胞存在的主要争论是癌症干细胞的定量。根据移植有效性认为结直肠癌干细胞低频度的假说不符合实际，因为后续实验显示实体瘤中癌症干细胞频度通常很高，而且现在的分析方法也存在极大限制。标志如CD133颇受诟病，可能是由于结直肠癌干细胞分化后仍没有mRNA下调。
癌症干细胞研究中，通过预后分析和生物标志决定治疗，但现有数据相互矛盾，特别是癌症干细胞标志方面的研究。可能是遗传学和表观遗传学不同，影响癌症干细胞标志表达；且标本间标志可能不相同；微环境压力下癌症前体细胞和干细胞转换使事情更复杂。直接来自结直肠癌病人的癌症干细胞信息更可靠，有助于理解研究模型的限制、解决争论。
结论
结直肠癌是实体瘤等级组成的最佳例子，瘤内包含一群不成熟的细胞，具有特殊的分子和功能特征。最初关于结直肠癌干细胞本质的假说正在分崩离析，而干细胞性是癌细胞持续适应微环境结果的这一观点正在壮大。
证据表明，无论是正常还是恶性细胞内，干细胞性源于各种信息的不断融合（遗传学突变和表观遗传学突变），包括细胞内源性特征、局部信号（化学、机械和分子）、随机事件和群体压力，这些因素不断塑造干细胞池。这种情况下发展成功的临床治疗需要深刻理解结直肠癌干细胞动态性、适应性和进化性的本质。
