蛋白质糖基化是一种关键的翻译后修饰（PTM），介导多种生物功能。异常糖基化与炎症和肿瘤等疾病密切相关。因此，糖基化是发现疾病相关生物标志物的重要靶点。糖基化具有宏观异质性（糖基化发生在不同位点）和微观异质性（每个位点有不同的糖型和结构），因此，相比于切糖分析，完整的糖肽分析能够揭示蛋白层面上的糖基化信息，这是糖蛋白组学具有挑战性的一项工作。通过质谱对糖肽进行完整表征已被证明是位点特异性糖蛋白组学分析和生物标志物筛选的通用工具。
近期，复旦大学乔亮教授团队联合SCIEX 团队、单宝珍博士（百蓁生物联合创始人）在Analytical Chemistry上在线发表了“Quantitative Site-Specific Glycoproteomics Reveals Glyco-Signatures for Breast Cancer Diagnosis”文章，该研究方法通过优化质谱分析方法和机器学习算法，从乳腺癌的临床样本中鉴定和定量位点特异性的糖基化特征，最终确定了15种位点特异性聚糖作为检测乳腺癌症的潜在生物标记。这种方法不仅为乳腺癌的早期诊断提供了新的生物标志物，也为其他疾病的糖蛋白组学研究提供了新的思路和工具。
研究方法
本研究对124份临床血清样本（乳腺癌患者、良性病变患者及对照组）进行糖蛋白组分析。通过对ZenoTOF 7600质谱仪动态碰撞能量设置的优化进行糖肽数据的采集，利用GlycanFinder 2.0等软件对糖肽进行鉴定与定量，进而利用主成分分析（PCA）和随机森林机器学习算法筛选位点特异性的糖基化标志物，并通过靶向MS/MS验证其在不同组间的差异表达，为乳腺癌的诊断提供潜在标志物。
研究结果
一、完整N-糖肽检测流程的建立
首先建立了完整糖肽鉴定质谱数据采集和数据分析的工作流程，探索了糖肽鉴定的质谱信息学解决方案。通过对比不同固定CE (collisional energy)和动态CE条件下的糖肽鉴定结果，发现动态CE在糖肽鉴定数量和位点特异性糖基鉴定数量上显著优于固定CE值。与PEAKS® Studio和 FragPipe糖肽解析软件相比，GlycanFinder 2.0在不同CE条件下的糖肽鉴定数量和得分表现最为稳定。
图1. 完整糖肽鉴定中不同碎裂条件和信息学解决方案的性能比较
二、乳腺癌血清糖蛋白组分析
利用上述确定的流程，研究人员分析了124名女性参与者的血清样本，其中包括40名乳腺恶性肿瘤（MT）患者、43名乳腺良性肿瘤（BL）患者和41名无乳腺疾病的对照组（Con），对每个样品进行蛋白质组学和糖蛋白组学分析（图2a）。在糖蛋白质组水平上，共鉴定出6901个独特位点特异性糖链，涉及807个糖基化位点，糖基化修饰以唾液酸化为主。
图2. 乳腺癌临床血清样本的糖蛋白组分析
三、乳腺癌糖蛋白组相比蛋白质组的差异分析
研究人员探索了MT、BL和Con中蛋白质组和糖蛋白组的定量结果。糖蛋白质组在MT、BL和Con之间表现出显著差异，而蛋白质组的差异较小。差异表达的位点特异性糖链，主要涉及凝血、糖胺聚糖结合、肽酶活性、免疫反应等功能。KEGG通路分析显示，补体和凝血级联反应在MT和BL中显著改变，胆固醇代谢在MT和BL中下调，而黏着斑和铁死亡通路在MT中上调。
图3. 乳腺癌血清糖蛋白组的定量差异与功能分析
四、乳腺癌诊断的N-糖生物标记的发现
为了从位点特异性聚糖中筛选潜在的生物标志物，研究人员使用随机森林来构建样本分类器。从位点特异性糖链中筛选出15个潜在的糖基标志物，用于构建乳腺癌检测的分类模型。该模型在训练集上实现了0.98的AUC值，并在验证集上达到了0.99的AUC值，显示出较高的诊断准确性。针对15个候选糖基标志物的靶向质谱分析进一步验证了其在乳腺癌诊断中的潜力。
图4.用于乳腺癌症诊断的位点特异性聚糖生物标志物筛选。
结论
文章提出了一种使用质谱进行完整糖肽表征的方法，并展示了其在临床血清样本的大规模位点特异性定量糖蛋白组分析中的应用。研究结果表明：位点特异性糖蛋白组为疾病生物标志物研究提供了令人兴奋的机会，该方法在基础和临床糖蛋白组学研究中具有广阔的潜力。
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糖蛋白质组学分析
百蓁生物（Baizhen Biotechnologies）是一家以AI驱动质谱技术，聚焦精准医疗的生物科技公司，是Bioinformatics Solutions Inc的中国分公司，公司不断深入优化完整糖肽和释放聚糖质谱分析技术，采用特有的PEAKS® GlycanFinder分析软件，提供对复杂样品的糖基化进行鉴定和相对定量分析服务。
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深:专利富集材料确保糖肽深度鉴定
多:多种碎裂方式组合确保糖肽离子信息丰富
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