我们在存在NTRK1激酶结构域的肺癌组织中鉴定了新型的基因融合状态，NTRK1基因能够编码高亲和力的神经生长因子受体（TRKA蛋白）。MRRIP-NTRK1及CD74-NTRK1融合都可以导致结构性的TRKA激酶活性的改变，从而发挥癌基因的作用。采用TRKA激酶活性抑制剂来治疗表达NTRK1融合基因的细胞，可以有效地抑制TRKA的自主磷酸化过程及细胞生长。我们在91例未知癌基因突变位点的肺癌患者中的其中3名患者组织中，采用二代测序的方法及免疫荧光原位杂交的方法有效地证明了NTRK1基因融合的存在。
采用口服活性激酶抑制剂克唑替尼或厄洛替尼、吉非替尼等在分别有着ALK基因融合或EGFR突变的患者当中的效果优于标准方案的化疗。其他的癌基因，包括ROS1、RET、FGFR1、FGFR2和FGFR3基因融合也在肺癌当中得到了验证，证明了靶向治疗在治疗干预上非常大的潜力。这些癌基因也同样发生在几种其他类型的恶性肿瘤当中，于是这类研究可以将靶向治疗拓展到其他肿瘤治疗的领域当中。
我们发现在36个患者当中，2例存在着框架内的基因融合，这两例都是女性不吸烟腺癌患者，肿瘤组织都存在NTRK1基因激酶结构域，可编码TRKA受体酪氨酸激酶，但是没有其它潜在的癌基因突变。我们采用RT-PCR及全cDNA克隆的方法确认了外显子和mRNA的表达状态。
在第一例患者组织当中发现，肌球蛋白磷酸化酶-Rho交互蛋白（MPRIP）的5’端被连接至NTRK1的3’端。MPRIP参与了肌动蛋白细胞骨架的调节，这与肺小细胞癌的某种基因融合状态有一定的关系，可以推断它可能导致TP53的早期终止。在存在外源性MPRIP-NTRK1 cDNA表达的293T细胞中我们发现了这种RIP-TRKA融合蛋白的表达（由MPRIP-NTRK1编码），这是一种恶性胸膜转移的标本，同时这个患者的肺癌组织起源细胞（CUTO-3）我们也进行了细胞培养。
CUTO-3细胞正是包含这种之前未定义蛋白MPRIP，这个蛋白在关键性分子TRKA酪氨酸残基中具备着自主磷酸化的能力。MPRIP有着3种卷取螺旋域（CCDs），其中一种可以介导肌球蛋白磷酸化的相互作用。ALK、ROS1和RET融合基因的伴侣经常包含CCD，被认为有着介导二聚体形成和催化随后激酶结构域活性的作用；于是，很可能包含着MPRIP-NTRK1的CCD都有着相似的功能。第二例患者组织内存在CD74-NTRK1基因融合。CD74编码主要的组织相容性复合物（MHC）二型恒定链，是一种已知的激活ROS1的融合伴侣，同时CD74-TRKA蛋白的融合被推测定位在细胞膜上。
我们采用了一种免疫荧光原位杂交（FISH）的方法来检测NTRK1基因内染色体的重排。这些探针的杂交显示出包含着MPRIP-NTRK1或CD74-NTRK1基因融合患者组织中5′及 3′端明确的分离，但是从这些样本的非肿瘤细胞或者对照组织中却没有这样的现象（图1）。NTRK1和TPM3、TFG或TPR之间的融合状态在之前的研究中，证实结肠癌和甲状腺癌中都有存在。尽管TPM3定位在NTRK1的近端，FISH也可在包含TPM3-NTRK1融合的KM12结肠癌细胞系中检测到5′及 3′端的分离。
采用这种FISH检测手段，56例未检测到癌基因突变的患者进行了NTRK1基因重排的筛查，其中1例检测到阳性并且最终被证实存在基因融合状态。定量PCR证实了NTRK1激酶结构域的高表达存在于已知NTRK1重排的肿瘤组织中，或KM12细胞系中。从癌症基因图谱的转录组分析中，发现230例肺腺癌组织中并未检测到NTRK1的融合。近期一项87例肺腺癌组织的转录组分析，鉴定了一系列之前未定义的基因融合，却不包括NTRK1癌基因的融合状态（J.-S. Seo，首尔大学医学院）。
为了正式证实这些突变是致癌性的，我们在其他3种常用的评估致癌能力的非肿瘤细胞系中过表达了MPRIP-NTRK1和CD74-NTRK1 cDNA结构，它们分别是293T细胞，NIH3T3纤维母细胞及Ba/F3细胞，并且通过它们来评估融合基因致癌的特性。我们观察相应大小的嵌合蛋白的表达以及TRKA的自主磷酸化过程，就像在CUTO-3中所看到的那样（图 1c 和 2b）。
图1. NTRK1融合基因的发现和验证。（a）采用二代测序的方法绘制MPRIP-NTRK1 和 CD74-NTRK1融合基因的图谱；（b）FISH分析MPRIP-NTRK1和 CD74-NTRK1融合中5’端和3’端的分离；（c）TRKA (NTRK1)融合基因的自主磷酸化过程，以及它们是下游信号通路的关键分子；（d）NTRK1支持肿瘤细胞的增殖。（e）MPRIP-NTRK1 或 CD74-NTRK1的基因融合存在致癌活性。分别采用RIP-TRKA, RIP-TRKA-KD, CD74-TRKA, EML4-ALK及空白对照来注射裸鼠，观察肿瘤生长的反应。
引入NTRK激酶失活突变并不能导致TRKA的自主磷酸化或者增加细胞外信号相关激酶1和2磷酸化的增加。MPRIP-NTRK1和CD74-NTRK1可以诱导非IL3依赖的Ba/F3细胞的增殖，但它们的激酶失活状态并没有类似的效果（图1d）。
同样，MPRIP-NTRK1 和 CD74-NTRK1支持着NIH3T3细胞贴壁非依赖性的生长，同时可在裸鼠中生长，CD74-NTRK1诱导着NIH3T3细胞的耐药性特点（图1e）。KM12细胞中TPM3-NTRK1的敲除可降低细胞增殖，进一步支持NTRK1作为致癌性融合基因的作用。
鉴于有着之前靶向治疗的成功经验，如肿瘤有着ALK和ROS1融合基因的患者采用激酶抑制剂进行治疗等。我们思考是否NTRK1融合基因可能在肺癌或其他恶性肿瘤当中提供类似的治疗靶点。因为ARRY-470是一种选择性的激酶抑制剂，对于TRKA、TRKB及TRKC有着毫微摩尔级的抑制活性，但是对于其他激酶没有低于1000nM的抑制活性。
除了这些激酶之外，来它替尼（CEP-701）和克唑替尼同样拥有抗TRKA的活性。采用ARRY-470, CEP-701都可以抑制表达MPRIP-NTRK1 或 CD74-NTRK1融合的细胞生长，以及克唑替尼也可以在较小的程度上抑制RIP-TRKA 和CD74-TRKA的自主磷酸化过程（图2b）。
在表达内源性MPRIP-NTRK1 或 CD74-NTRK1的Ba/F3细胞中，促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活和AKT激酶途径也同样可以受到药物的抑制（图2b）。内源性表达RIP-TRKA磷酸化的CUTO-3细胞，以及内源性表达原肌球蛋白（TPM3）-TRKA的KM12细胞，同样可以受到这3种药物的抑制（图2c）。
对于有着NTRK1基因融合的Ba/F3细胞来说，采用CEP-701和ARRY-470来抑制它们的生长是十分有效的。克唑替尼是一种作用较弱的抑制剂，即使是在EML4-ALK或SDC4-ROS1融合基因的存在下。克唑替尼对细胞生长抑制作用的温和是与TRKA磷酸化抑制的下降以及下游ERK1/2的磷酸化密切相关的（图2b）。
图2.药物治疗抑制存在NTRK1融合基因细胞的TRKA活性、下游信号以及细胞增殖；（a）NTRK1基因的RNAi敲除可抑制存在TPM3-NTRK1融合基因的细胞增殖；（b）采用不同浓度的吉非替尼和DMSO对照来诱导表达MPRIP-NTRK1 (RIP-TRKA) 或 EV融合基因的Ba/F3细胞5小时，之后检测它们TRKA及ERK磷酸化的表达；（c）采用不同浓度的药物来诱导表达MPRIP-NTRK1 融合的CUTO-3肺癌细胞，并且采用western blot的方法检测下游信号；（d）采用MTT的方法来检测表达MPRIP-NTRK1的Ba/F3细胞对于泛TRK抑制剂的效果，ARRY-470及CEP-701有效，而吉非替尼无效。
所有这三种药物都同样可以抑制表达NTRK1基因融合NIH3T3细胞在软琼脂中的克隆形成。KM12细胞对于ARRY-470 及 CEP-701的敏感性相似，但是对于克唑替尼较弱。ARRY-470并不抑制表达其他癌基因靶点的Ba/F3细胞的增殖，如EGFR、ALK或ROS1等，对于没有NTRK1基因融合的肺癌和结肠癌细胞系也没有效果。所有3种药物在G1期诱导细胞周期停滞，以及可以诱导KM12细胞的凋亡。
上文所说的这个存在MPRIP-NTRK1融合基因的患者目前没有标准方案的治疗，也没有临床试验证实TRKA抑制剂的有效性，因此，这个患者只能在临床试验之外自愿接受克唑替尼（250mg每天2次）的治疗。这个患者在服药后影像学观察到了小程度的缓解，同时血清肿瘤标记物CA125也有所降低，但是疾病在3个月后发生了进展。克唑替尼在临床治疗中温和的药效与它在体外实验中我们观察到的是一致的，有可能是由非TRKA激酶通路的作用导致的。
