内标掺入 SILAC 法用于小量组织的蛋白质组及磷酸化蛋白质组定量

2020-07-24 11:55 来源:赛默飞 作者:唐家澍
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关键词

spike-in SILAC,小量组织,定量蛋白质组,磷酸化蛋白质组,胰岛

前言

非靶向蛋白质组学中有多种定量方法用于研究蛋白质表达以及翻译后修饰的调控,总体来说分为三类:非标记定量(label free),体内代谢标记和体外化学标记。稳定同位素氨基酸培养掺入标记(Stable Isotope Labeling by Amino acid in Cell culture, SILAC)是使用最为广泛的一种体内代谢标记方法[1],除了能都实现对细胞系样品实的定量研究外,SILAC 方法还可以用于组织样品的定量蛋白质组学研究。通过使用合适的 SILAC 标记的细胞系样品作为内标,我们可以对组织样本的全蛋白质组 [2],乃至翻译后修饰[3] 进行系统的定量研究。

磷酸化信号级联是生物体信号传导的关键分子机制,因此磷酸化蛋白质组学的研究一直是生物学研究的热点之一。磷酸化修饰在体内的丰度很低,因此需要对磷酸化肽段进行富集才能够通过质谱分析得到较好的鉴定结果。磷酸化肽段的富集方法主要包括固定化金属亲和色谱(Immobilized Metal Affinity Chromatography,IMAC)[4],二氧化钛(Titanium dioxide, TiO2[5] 以及基于抗体的富集方法[6]。受到蛋白质起始量的限制,在小量组织中进行磷酸化蛋白质组学的分析难度较大。在这篇工作中,我们采用适合小量组织的磷酸化蛋白质组学工作流程,结合内标掺入 SILAC 的定量方法对大鼠胰岛进行了蛋白质组以及磷酸化蛋白质组的定量研究。

实验方法

1. 样品处理

INS-1E 细胞采用 SILAC 培养基培养,其中掺入 L-[13C6,15N2]-lysine(Lys8),L-[13C6,15N4]-arginine • HCl(Arg10)和普通脯氨酸(L-proline)。胰岛分离自 6 周雄性 Wistar 大鼠,具体步骤参考文献[7]。实验设计和工作流程见图 1。

2. 色谱条件

高效液相色谱仪:Easy nLC 1200(ThermoFisher Scientific)
分析柱:自制 C18 纳升级喷针柱,长度 20 cm,内径 75 µm,粒径 3 µm
流动相:A,0.1% 甲酸/水;B,0.1% 甲酸/80% 乙腈
梯度:0-2 min,4-8% B;2-125 min,8-28% B; 125-140 min,28-40% B;140-142 min,40-99% B;142-150 min,99%B
流速:300 nL/min

3. 质谱采集方法

质谱仪:Orbitrap Fusion Lumos(ThermoFisher Scientific)
离子源:NanoFlex;离子模式:正离子;喷雾电压:1.9 Kv;离子传输管温度:300 度;S-lens RF:30%
分辨率:一级 120 K,二级 15 K;AGC:一级 4e5, 二级 5e4;MaxIT:一级 20 ms,二级 100 ms;
碰撞能量:32%

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编辑: 翟超男

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