第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所（400037）
孙建国
Livin 是近年来发现的人类凋亡抑制蛋白家族的新成员，存在同基因不同剪切的两种异构体：Livinα和Livinβ，二者不仅抗凋亡生物学功能有差异，而且具有不同的组织表达谱，在体内有复杂的作用机制。Livin 在人正常肺组织及癌旁组织中不表达或低表达，却在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中激活表达，并且经过化疗的患者Livin 表达水平明显升高，这可能是临床上肺癌发生耐药的机制之一。利用RNA 干扰（RNAi）技术阻断Livin 基因表达，可望成为逆转肺腺癌细胞化疗抗性的良好策略。
分别设计针对Livinα＋β、Livinα和Livinβ的siRNA 作用位点，分子克隆法构建小干扰RNA（siRNA）表达载体，电穿孔法转染SPC-A1 细胞及G418 抗性筛选后，分别建立Livin 异构体特异性基因沉默体系pSilencer-Livinα＋β、pSilencer-Livinα和pSilencer-Livinβ。体外实验用甲基偶氮唑蓝（MTT）法，根据细胞存活率绘制浓度效应曲线，确定半数抑制浓度（IC50），研究Livin 基因沉默后SPC-A1 细胞对氟脲嘧啶（5-FU）、甲氨喋呤（MTX）、环磷酰胺（CTX）、顺铂（DDP）、卡铂（CBP）、多柔比星（ADM）、表柔比星（EPI）、足叶乙甙（VP16）、替尼泊甙（VM-26）和长春新碱（VCR）等化疗药物的敏感性改变；体内实验利用荷瘤裸鼠模型，腹腔注射顺铂，根据化疗前后肿瘤体积变化计算肿瘤抑制率，研究Livin 基因沉默后荷瘤小鼠对顺铂的敏感性改变。
经酶切鉴定和测序验证，分别获得针对Livinα＋β、Livinα和Livinβ的siRNA 重组载体，经基因转染及G418 筛选后获得稳定克隆，其中pSilencer-Livinα＋β和pSilencer-Livinβ的沉默效率达80%，pSilencer-Livinα的沉默效率约为60%。体外实验，IC50 分析结果显示，转染细胞对不同化疗药物敏感性较对照组细胞明显增强，其中，pSilencer-Livinα＋β组细胞对几乎所有的化疗药物表现为敏感性增加（P＜0.01）；pSilencer-Livinα组细胞具有相似的效应，对多种化疗药物如MTX、CTX、CDDP、CBP、ADM、EPI 以及VCR 表现为增敏效应（P＜0.05）；而pSilencer-Livinβ组细胞则对VP16 和VM26两种化疗药物表现出特有的增敏作用（P＜0.05）。体内实验，对照组小鼠肿瘤生长潜伏期为5～6 天，实验组小鼠生长潜伏期为7～8 天，当肿瘤长至8～10mm 时，给以腹腔内注射DDP，各组荷瘤裸鼠在给予化疗药物后第5 天、第10 天和第15 天移植肿瘤体积随时间延伸而逐渐缩小，pSilencer-control 组肿瘤体积缩小最慢，pSilencer-Livinα＋β组肿瘤体积缩小最快，pSilencer-Livinα组与之接近，与pSilencer-control 组相比有统计学意义（P＜0.01），而pSilencer-Livinβ组肿瘤体积稍大，但仍然显著小于对照组（P＜0.05）。pSilencer-Livinα＋β组，pSilencer-Livinα组和pSilencer-Livinβ组抑瘤率分别为146.1%、130.7%、110.5%。
实验表明，Livin 异构体尤其是Livinα＋β可作为肺癌细胞化疗增敏的分子靶点，其基因沉默有望成为肺腺癌基因治疗新手段。
