胸部肿瘤和内镜:Livin异构体基因沉默对肺腺癌SPC-A1细胞化疗增敏效应研究

2007-09-07 00:00 来源:丁香园 作者:丁香园通讯员
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第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所(400037)

孙建国

    Livin 是近年来发现的人类凋亡抑制蛋白家族的新成员,存在同基因不同剪切的两种异构体:Livinα和Livinβ,二者不仅抗凋亡生物学功能有差异,而且具有不同的组织表达谱,在体内有复杂的作用机制。Livin 在人正常肺组织及癌旁组织中不表达或低表达,却在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中激活表达,并且经过化疗的患者Livin 表达水平明显升高,这可能是临床上肺癌发生耐药的机制之一。利用RNA 干扰(RNAi)技术阻断Livin 基因表达,可望成为逆转肺腺癌细胞化疗抗性的良好策略。

    分别设计针对Livinα+β、Livinα和Livinβ的siRNA 作用位点,分子克隆法构建小干扰RNA(siRNA)表达载体,电穿孔法转染SPC-A1 细胞及G418 抗性筛选后,分别建立Livin 异构体特异性基因沉默体系pSilencer-Livinα+β、pSilencer-Livinα和pSilencer-Livinβ。体外实验用甲基偶氮唑蓝(MTT)法,根据细胞存活率绘制浓度效应曲线,确定半数抑制浓度(IC50),研究Livin 基因沉默后SPC-A1 细胞对氟脲嘧啶(5-FU)、甲氨喋呤(MTX)、环磷酰胺(CTX)、顺铂(DDP)、卡铂(CBP)、多柔比星(ADM)、表柔比星(EPI)、足叶乙甙(VP16)、替尼泊甙(VM-26)和长春新碱(VCR)等化疗药物的敏感性改变;体内实验利用荷瘤裸鼠模型,腹腔注射顺铂,根据化疗前后肿瘤体积变化计算肿瘤抑制率,研究Livin 基因沉默后荷瘤小鼠对顺铂的敏感性改变。

    经酶切鉴定和测序验证,分别获得针对Livinα+β、Livinα和Livinβ的siRNA 重组载体,经基因转染及G418 筛选后获得稳定克隆,其中pSilencer-Livinα+β和pSilencer-Livinβ的沉默效率达80%,pSilencer-Livinα的沉默效率约为60%。体外实验,IC50 分析结果显示,转染细胞对不同化疗药物敏感性较对照组细胞明显增强,其中,pSilencer-Livinα+β组细胞对几乎所有的化疗药物表现为敏感性增加(P<0.01);pSilencer-Livinα组细胞具有相似的效应,对多种化疗药物如MTX、CTX、CDDP、CBP、ADM、EPI 以及VCR 表现为增敏效应(P<0.05);而pSilencer-Livinβ组细胞则对VP16 和VM26两种化疗药物表现出特有的增敏作用(P<0.05)。体内实验,对照组小鼠肿瘤生长潜伏期为5~6 天,实验组小鼠生长潜伏期为7~8 天,当肿瘤长至8~10mm 时,给以腹腔内注射DDP,各组荷瘤裸鼠在给予化疗药物后第5 天、第10 天和第15 天移植肿瘤体积随时间延伸而逐渐缩小,pSilencer-control 组肿瘤体积缩小最慢,pSilencer-Livinα+β组肿瘤体积缩小最快,pSilencer-Livinα组与之接近,与pSilencer-control 组相比有统计学意义(P<0.01),而pSilencer-Livinβ组肿瘤体积稍大,但仍然显著小于对照组(P<0.05)。pSilencer-Livinα+β组,pSilencer-Livinα组和pSilencer-Livinβ组抑瘤率分别为146.1%、130.7%、110.5%。

    实验表明,Livin 异构体尤其是Livinα+β可作为肺癌细胞化疗增敏的分子靶点,其基因沉默有望成为肺腺癌基因治疗新手段。

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