肝癌早期诊断血液标志物 DNA 羟甲基化(5 hmC)新突破

2019-08-05 17:11 来源:丁香园 作者:
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我国作为肝癌高发国家,占全球肝癌发病率 50% 以上。目前,肝癌是我国第 4 位常见恶性肿瘤及第 3 位肿瘤致死病因。我国的肝癌患者具有其鲜明的特点,多具有肝炎和肝硬化背景。其中大约 80% 的肝癌与乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染有关,这也与肿瘤的治疗方式选择和预后密切相关。

针对原发性肝癌,现今主要的治疗方案有手术切除、经导管动脉化疗栓塞、射频消融、靶向药物、肝移植、放射治疗及化疗等 。其中肝癌的外科治疗已经取得了较大的进步,术后 5 年生存率也提高到 30 %~40 %。但相对于其他消化道恶性肿瘤相比,肝癌的外科治疗效果尚不能令人满意,主要原因是肿瘤复发与转移。要解决此类问题,临床攻关方向上主要从两个方面着手: 早期诊断和选择个体化综合治疗方法。

复旦大学附属中山医院的樊嘉院士和国家肝癌科学中心/东方肝胆外科医院的王红阳院士与美国芝加哥大学何川教授和美国西北大学张玮教授合作,将外周血 5 hmC 技术引入肝癌领域。两位院士牵头,共同发起了一项多中心肝癌早期 5 hmC 标志物检测的临床研究,利用外周血 5 hmC 信号变化,依托高通量基因组测序技术进行肝癌早期诊断。樊嘉院士和王红阳院士是中国肝癌研究的知名专家,多方强强联手,通过大样本的临床研究,将为中国肝癌早期诊断提供一个全新的技术方案、为临床积累极具价值的经验。

一、肝癌血液标志物的回顾

  • 甲胎蛋白(AFP)

血清 AFP 检查方法可以回溯到 1971 年开始用于肝癌的筛查,是目前全世界应用广泛的 HCC 肿瘤标志物,诊断 HCC 的敏感度为 39%~65%,特异度为 76%~94%。其敏感度和特异度在具有小肿块的 HCC 早期阶段,80% 的患者血清 AFP 并未见明显升高,在肿块直径<3 cm 和>3 cm 的 HCC 患者中,AFP 的检测敏感度分别为 25% 和 52%。利用 AFP 进行肿瘤筛查,存在的主要问题是早期时阳性率较低。特别是我国约有 30% 肝部病人的 AFP 阴性,单独用 AFP 检查会遗漏这部分病人。所以,通常需要联合超声检查以提高敏感度。

  • 甲胎蛋白异质体 3(AFP-L3)

AFP-L3 是 AFP 异质体的一种,为肝癌细胞特有,常用 AFP-L3 与 AFP 的百分比作为 HCC 早期诊断的标志物。AFP-L3 在肝癌恶性程度评估、治疗效果和预后判定方面有着重要的临床价值和意义。

  • 异常凝血酶原 (DCP)

异常凝血酶原(DCP)是一种由维生素 K 缺乏所致的异常凝血酶原蛋白,在恶性肿瘤细胞中由于凝血酶原前体翻译后羧基化缺陷而产生。DCP 在部分国家和地区例如被日本、韩国及印度,被批准作为 HCC 的有效标志物。

  • 高尔基体蛋白 73(GP73)

GP73 在正常人的肝细胞中表达量极低或者不表达,而在肝癌患者血清中明显升高。有研究显示在低水平 AFP 小肝癌患者中,GP73 检测敏感度和特异度分别为 72.0% 和 94.0%,提示 GP73 是一个有价值的小肝癌的辅助诊断标志物,但还需要临床研究加以验证。

  • 磷脂酰基醇蛋白聚糖 3(GPC-3)

磷脂酰基醇蛋白聚糖 3(GPC-3)是一种存在细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白,部分研究结果显示 GPC-3 的敏感度和特异度分别为 36%~65%、65%~100%,且在小肝癌的检测方面敏感度优于 AFP。

  • 血清 miRNA

外周血中 miRNA 是一种高度保守的单链非编码小 RNA,长度为 20~25 个核苷酸,参与各种各样的调节途径,包括发育、细胞增殖和凋亡及肿瘤发生。大量研究表明 miRNA 在肿瘤中起着促癌基因或抑癌基因的作用,并能同时调节多个靶基因,参与肿瘤的发生发展。近年来通过分析肝癌患者和正常人血清样本中表现出显著差异的 miRNA,可筛选对肝癌患者诊断和预后有着潜在的指示作用的标志物。多项研究均显示多种 miRNAs 在肝癌诊断方面具有高特异度及敏感度,例如樊嘉院士团队历经 9 年攻关,从血浆中筛选到由 7 个 miRNA 组成的早期肝癌诊断分子标记物,可准确诊断肝癌,灵敏度和特异性均达 80% 以上。应用该试剂,进行血液检测同时配合影像学检查,还能显著提高对包括小于 2 厘米小肝癌在内的各种临床分型肝癌诊断效能,以此降低漏诊率和误诊率。血清 miRNA 作为生物分子标志物已展现出良好的应用前景,不仅有助于肝癌的早期诊断和预后评价,也是一个肝癌早期无创检测的潜在标志物。

  • 循环肿瘤细胞(CTCs)

循环肿瘤细胞(CTCs)是肿瘤原发灶或者转移性病灶脱落进入外周血液循环系统的肿瘤细胞。目前肝癌 CTC 研究还处于探索阶段,主要研究报道集中在肝癌的疗效评价和预后等方面。樊嘉院士团队的临床研究发现「循环干细胞样肝癌细胞」可作为肝癌切除术后复发预测新指标。团队自主研发多种 CTC 分选检测技术,并研制全球首台「全自动循环肿瘤细胞分选检测系统」原型机和检测试剂盒。该技术可实现「从全血标本→CTC」的一站式全自动样本处理(包括血液离心,液体处理,CTC 捕获,细胞染色等步骤);捕获 CTC 灵敏度达 90% 以上,同时可用于下游单细胞测序分析,揭示每个 CTC 细胞的基因突变和表达谱,这将为临床实现肝癌早诊早治、有效预测复发、疗效监测以及干细胞研究建立良好平台。

二、表观遗传学技术在肝癌检测中的应用

基因 DNA 甲基化是目前研究较为深入的一种表观遗传学机制,DNA 甲基化不涉及 DNA 序列的改变,往往要早于肿瘤发生的遗传学机制,所以在肿瘤的早期诊断上有着特殊的应用价值。2017 年,加州大学张康教授利用甲基化技术对肝癌患者 ctDNA 进行了深入研究。通过分析 715 个肝癌患者 ctDNA 和 560 个正常样本的临床数据。该模型在训练组(AUC = 0.966)中特异性为 94.3%,灵敏度为 85.7%;在验证组 (AUC = 0.944) 中特异性可达 90.5%,灵敏度达到 83.2%。

三、肝癌早诊中 5 hmC 标志物的临床研究

▶ 3.1 研究概述

本研究是一项多中心临床试验,在中山医院、东方肝胆医院等同步进行。利用 5 hmC 检测技术 5 hmC-Seal 捕获外周血 cfDNA 中的 5 hmC 序列,测量分析 5 hmC 水平,并对 5 hmC 修饰水平进行标准化处理后,利用生物信息学工具,在前肝癌组和正常人组之间寻找有显著修饰水平差异 5 hmC 基因位点。随后利用回归模型对如上所得到的差异位点进一步筛选、优化,从而得到一组具有高度灵敏度和特异性的 5 hmC 生物标记物。进一步,所得的生物标记在独立样品中进行验证。

▶ 3.2 试验设计

本研究共入组了 2554 例受试者,其中肝癌患者 1204 例,慢性乙肝患者或肝硬化 392 例,健康对照 958 例。收集受试者血浆,分离 cfDNA。利用 5 hmC-Seal 技术进行 5 hmC 捕获,然后通过 NGS 进行测序分析。其中,训练组 1120 例样本,早期肝癌组 335 例,慢性乙肝患者或肝硬化 263 例,对照 522 例。通过早期肝癌 vs 健康对照组,早期肝癌 vs 慢性乙肝患者或肝硬化组,筛选 5 hmC 表达特征量,用于建模。应用建立的模型对验证组进行性能验证,在验证组队列 1(1194 例)中有早期肝癌 220 例、慢性乙肝患者或肝硬化史患者 167 例、晚期肝癌 442 例、肝癌未分期 147 例、慢性乙肝患者或肝硬化 129 例、健康对照 256 例;在验证组队列 2(240 例)中有早期肝癌 24 例、晚期肝癌 13 例、肝癌未分期 23 例、健康对照 180 例。

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图 1 研究方案路线图

四、研究结果分析

▶ 4.1 5 hmC 信号特征分析

5 hmC-Seal 数据显示同一组来源的样本具有很高的相关性,表明技术可靠性,以及各组不同来源的临床样本之间 5 hmC 信号具备可比性(Pearsons』 r > 0.99 图 2A)。通过随机 50 例肝癌和 50 例健康组样本分析,5 hmC 谱显示 5 hmC 富集区域主要位于转录起始(TSS)和转录末端(TES)之间的区域(图 2B)。

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图 2  5 hmC 测序图谱分布。

▶ 4.2 模型构建及诊断表现

研究者首先在训练组中选取了 917 个候选标志基因,这些基因在肝癌组与健康对照组以及肝癌组与慢性乙肝患者或肝硬化史患者中显示显著的 5 hmC 差异修饰水平。利用弹性网络正则化方法及逻辑回归建模方法筛选 32 个标志物的组合(图 3A-B)。根据对 32 个标志物进行权重诊断评分,可区分早期肝癌和非肝癌组,也可以区分早期肝癌和健康对照组(图 3C-D)。5 hmC 模型预测性能明显优于 AFP,在训练组和验证组 1 中区分早期肝癌和非肝癌人的曲线下面积(AUC)为 71.4-81.4%(图 3C-D)。更为重要的是 5 hmC 模型可以区分出 AFP(cutoff 值 = 20ng/mL)误判为阴性的人群,例如训练组中 160 例早期肝癌患者被 AFP 误判,而 5 hmC 模型可达到 92.4% 的 AUC。

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图 3 5 hmC 位点筛选和诊断模型构建。

此外,将 5 hmC 标志物结合 AFP 可进一步提高 AUC 的表现(图 3C-D)。早期肝癌与慢性乙肝患者或肝硬化患者的鉴别诊断是目前最具挑战的临床诊断难题。在训练组和验证组 1 中,5 hmC 表现要优于 AFP,5 hmC 的 AUC 可分别达到 87.3% 和 84.6%(图 3E)。该诊断模型可准确区分早期肝癌和慢性乙肝患者或肝硬化患者。

▶ 4.3 5 hmC 标志物跟临床分期相关且具有备肝组织特异性

通过训练组和验证组分析,5 hmC 判别评分在肝癌组中高于健康对照组,而早期肝癌评分也显著高于慢性乙肝患者或肝硬化患者(图 4)。判别评分随着巴塞罗那临床肝癌 BCLC 分期升高而增加。5 hmC 模型显示出了在鉴别 0 期患者和非肝癌人群中出色的区分能力,在训练组中 AUC 可达 90.4%,在验证组中 AUC 可达 87.1%。值得注意的是,5 hmC 评分可区分小肿瘤肝癌患者(≤ 2.0 cm)和非肝癌患者,AUC 可达 85.1%。

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图 4  不同组别的 5 hmC 模型评分分布。

▶ 4.4 诊断模型标志物靶基因的生物学

主要的诊断标志物靶基因 5 hmC 谱显著与肝来源 H3K4me1 或 H3K27ac 峰区域、预测的增强子的 5 hmC 谱相关。图 5 显示在一个随机选择肝癌患者和健康组代表性数据中以 2 个基因 ESRRG 和 SOX9 为例,结果提示 5 hmC-Seal 片段读数和数据库 Roadmap Epigenomics Project、Encyclopedia of DNA Elements Project (ENCODE) 中 H3K4me1 或 H3K27ac 峰重叠。917 个候选基因在 KEGG 注释中主要涉及代谢过程(如碳、氨基酸),例如「乙醛酸盐和二羧酸盐代谢」、「甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢「,以及肝功能如「胆汁分泌」,「补体和凝血级联」。这些途径中的许多候选基因与肝癌、乙型肝炎病毒感染或纤维化的生理发病机制有关,例如「补体和凝血级联」中的 A2M、KNG1、酪氨酸和苯丙氨酸代谢中的 ALDH3A1。

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图 5 候选基因之 ESRRG 和 SOX9 的 5 hmC 分布。

此外,利用肿瘤基因组图谱(TCGA)基因数据,对 cfDNA 中 5 hmC 标志物的基因表达相关性进行了探索。在早期肝癌与健康对照组之间 5 hmC 差异修饰排名靠前的基因同样在 TCGA 中排名靠前的差异表达基因中富集,提示患者来源 cfDNA 中 5 hmC 标记物与基因表达相关。

五、5 hmC 在早期肝癌诊断中性能优秀,为临床应用奠定坚实基础

本研究中大样本(2554 例)的临床研究显示,5 hmC 模型不仅准确区分早期肝癌患者和健康对照人群,同时还可区分早期肝癌患者和慢性乙肝患者或肝硬化患者。此外,该 5 hmC 诊断模型具有肝癌组织特异性特征。功能分析显示了 5 hmC 作为标志物的潜在背景机制,也促进了对肝癌发病机制的理解。相信未来更多的包括回顾性研究和前瞻性的临床研究,将进一步验证 5 hmC 模型的性能,并最终建立无创 5 hmC 肝癌临床诊断模型。高度敏感的 5 hmC 检测技术在早期肝癌研究中的发现为开发泛癌种、无创血液诊断和筛查工具奠定了坚实的基础。

研究者介绍

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樊嘉,中国科学院院士,复旦大学附属中山医院院长、上海市肝病研究所所长、复旦大学肝癌研究所常委副所长。现任中国医师协会外科分会肝脏外科医师委员会主任委员、FACS 等。曾任抗癌协会肝癌专业委员会主任委员、中华医学会肿瘤学分会主任委员等。长期致力于肝肿瘤外科临床诊疗、基础研究及教学工作。首创肝癌门静脉癌栓多模式综合治疗技术,使伴门静脉癌栓的晚期肝癌由不可治变为部分可治。曾获教育部自然科学奖一等奖、国家科技进步二等奖、 「2016 年谈家桢奖」、「2016 年何梁何利奖」、「吴阶平-保罗杨森医学药学奖」等诸多奖项。

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王红阳,中国工程院院士,现任国家肝癌科学中心主任,东方肝胆外科研究所副所长,东方肝胆外科医院综合治疗二科主任,兼任国家自然科学基金委医学部主任、国家「863」计划和现代化医学技术领域专家。曾获曾获国家科学技术进步奖(创新团队奖)、国家自然科学二等奖、何梁何利基金科技和技术进步奖等诸多奖项。长期从事肿瘤信号转导的基础与临床研究,对肿瘤医学研究有重要建树。

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何川,美国芝加哥大学化学系终身教授、John T. Wilson 讲席教授、芝加哥大学生物物理动力学研究院主任、芝加哥大学癌症研究中心会员、美国霍华德休斯医学研究所(HHMI)研究员、北京大学长江讲座教授,开设合成与功能分子生物中心,并任主任;参与筹建北京大学未来基因诊断高精尖创新中心;迄今已经发表 300 篇 SCI 学术论文,在国际顶尖期刊(Nature、Science、Cell)正刊发表研究文章超过 20 篇。2017 年 2 月 22 日,《Nature》News 大篇幅介绍何川教授利用化学标记方法重新发现了 DNA 和 RNA 的表观遗传功能以及该领域的发展过程,充分肯定何川教授在表观遗传学研究中的开拓性贡献。

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张玮,美国西北大学芬伯格医学院预防医学系、Lurie 癌症研究中心、以及遗传医学中心教授,并兼任伊利诺伊大学医学院药理系教授。生物信息学及大数据分析专家,长期从事癌症生物标志物、人类遗传学、癌症药物基因组学的研究工作,发表 SCI 论文 140 余篇,专著 3 部,论文被引用超过 5000 次。曾获美国癌症研究学会 Merck Co. 学者奖,多种学术期刊编委和审稿人,以及美国 NIH/NCI 癌症分析技术专项基金的评审委员。

5 hmC 背景介绍

5-甲基胞嘧啶 (5-mC) 是 DNA 胞嘧啶环中第五碳通过脱氧核苷酸甲基转移酶(DNMT)甲基化所形成,在哺乳动物胚胎发育以及疾病发生发展中起着重要的作用。5-mC 经过 Ten–eleven translocation(TET) 的氧化作用形成 5 hmC,研究显示羟甲基化在正常基因组中表达量相对稳定,表明羟甲基化有独特的表观修饰作用,不仅仅是 5mC 代谢的中间产物。5 hmC 与包括癌症在内的多种疾病相关,在多种肿瘤组织中低水平的 5 hmC 得到证实。5 hmC 水平的高低与肿瘤的类型及临床分期也有着密切的关系,如肺癌中,随着病理分期发展,5 hmC 的水平进行性下降。肠癌、胃癌和食管癌的临床研究也显示出来 5 hmC 能够准确区分癌症患者和健康对照人群,在胃癌的临床数据中可以看到灵敏度和特异性可同时达到 90% 以上,具有较高的临床应用价值。基于化学捕获的 5 hmC 检测技术是一种新的液体活检技术,利用高通量测序并比对分析的方法可获得更为精确的 5 hmC 的基因图谱。利用该技术,有望克服目前液体活检 CTC、ctDNA 敏感性和特异性不够高的缺陷,使得肝癌早诊成为现实。

复旦大学附属中山医院蔡加彬博士,张歆昱博士和东方肝胆外科医院陈磊研究员,美国西北大学张舟博士为该文章共同第一作者。


编辑: 翟超男

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