此次 2018 年厦门 CSCO 学术年会期间，科维思主办了一场「数字 PCR 在肿瘤液体活检中的应用」主题卫星会。借此机会，丁香园很荣幸邀请到了两位大会主席——知名肿瘤专家徐兵河和王洁教授，以及科维思 CEO 王焱博士从各自不同的角度来解答数字 PCR 应用的相关问题，并分享各自的观点。
徐兵河教授在乳腺癌方面有非常多自己的见解，鉴于液体活检如今非常热门，但在乳腺癌领域属于起步阶段，因此丁香园与徐教授就数字 PCR 与乳腺癌进行了交流探讨。
【专家对话｜丁香园采访徐兵河教授内容详情】
丁香园：恶性肿瘤具有高度异质性的特点，不管是在诊断还是在治疗的阶段，都需要关注它的动态变化。目前液体活检的产品研发也非常活跃，并且有逐渐取代组织活检产品的势头，您是怎样看待这样一个趋势的呢？
徐兵河教授：目前肿瘤治疗已经进入个体化和精准治疗时代，个体化和精准治疗要求诊断非常精确和方便。要满足这两点，就要先了解组织活检和液体活检哪个更方便，答案当然是液体活检更方便一些。因为组织活检需要取得原发或转移的肿瘤肿块，而很多肿瘤并不方便获取，比如肿瘤的部位比较深或比较隐蔽，就很难实现取样。众所周知，液体活检是通过抽血等方法来取样，这种方式非常方便，而且可以进行动态的监测。另外在精准方面，如果肿瘤已经被切除，没有肿瘤之后就不能进行动态监测，或者由于肿瘤部位或其他原因无法进行活检，那么也将做不到动态的监测。而液体活检可以随时取样，比如说利用血液标本就可以进行动态的监测，这是其方便之处，现今的一些检测结果也证明了其精准性。液体活检包括两个最重要的检测，一个是 ctDNA 的检测，另一个则是循环肿瘤细胞的检测。不同检测有不同优缺点，但是都非常方便。这种检测目前也证实了与肿瘤组织的检测基本相当，而且能够进行大样本的动态监测。所以我觉得如果它能做到既方便又精准，那么至少在某些方面有取代组织活检的可能。
丁香园：在液体活检当中有非常多的方法，其中有一个是数字 PCR，它可以比较高效、精准，而且定量地检测目的基因的变化，并且成为肿瘤动态检测研究的应用热点。那您是怎样评价数字 PCR 在肿瘤领域当中的应用前景呢？
徐兵河教授：如你所说，液体活检的方法有很多，二代测序也就是 NGS 是其中使用较多的方法。NGS 可以检测数百个甚至上千个基因，而且检测的深度也各不相同，有的可以检测得非常深。检测得深当然有好处也有坏处，其可以发现一些不常见的突变，但是也可能会带来假阳性结果；如果检测得浅，则发现的突变相对少一些，但是也会相对比较准一些。临床上有时候不需要检测很多基因，作为研究，我们当然希望检测的基因越多越好，但是在临床上检测的基因过多可能就做不到检测的精准度、深度和绝对定量，而且会增加病人的检测费用，检测时间也会更长。针对某一点或某一基因的突变做单个基因的检测，数字 PCR 就能够满足这种要求，它可以做到精准，同时还可以实现定量和动态。所以我觉得这也是液体活检的一种重要方法，满足了很多病人和医生的临床需求。
丁香园：乳腺癌是一种异质性比较强的肿瘤类型，对于这样的疾病在病程监控和复发转移方面，主要应该关注哪些指标，可以给我们做一些分享吗？
徐兵河教授：我们将乳腺癌分成至少 4 个亚型，分别为 Luminal A 型、Luminal B 型、三阴性型和 HER-2 过表达型。不同乳腺癌病人的治疗策略不一样，预后也不一样。所以我们在做某一个诊断或者某一个检测的时候，如果已知他是一个 HER-2 阳性的乳腺癌病人，那么检测时可能就会更关注 HER-2 基因的检测。数字 PCR 技术就可以满足这个需求，通过动态监测 HER-2 基因的突变情况，看病人是对药物敏感还是产生了耐药性，检测方式也较简便。通过定性和定量的动态监测，可以满足我们临床的需求和病人对于治疗的需求。我们之前也做过该方面的一些研究，最早研究过「动态监测循环肿瘤细胞中的 HER-2 蛋白」的检测，通过动态监测 HER-2 蛋白量的变化，判断病人是否产生了耐药还是继续敏感。如果该蛋白的含量越来越高，证明 HER-2 基因正在扩增，或许治疗根本没起到很好的效果；但如果经过治疗后，该蛋白的含量逐渐下降，则证明肿瘤细胞也相应在减少，可以间接反映治疗的效果，同时也能判断肿瘤病人的预后。有时经过手术切除后，我们根本看不到肿瘤，但血液中可以检测到 HER-2 蛋白，若检测值越来越高，则提示该肿瘤可能会复发。所以液体活检技术在乳腺癌中也有很好的应用前景。
丁香园：科维思旗下其实也有覆盖乳腺癌的一个数字 PCR 产品，在当下的临床实践中，根据您的了解，基于数字 PCR 的液体活检技术，能够为乳腺癌的患者在预后和生存方面带来怎样的改善？
徐兵河教授：数字 PCR 可以对不同亚型的乳腺癌进行动态监测。第一，可以判断病人的预后。对预后差的病人，或许需要加强治疗或是更换治疗方案。另外，在治疗过程中通过动态监测也可以判断疗效，以及病人是否产生耐药性。所以我觉得通过这种监测来判断预后，能够有助于改善乳腺癌病人的最终治疗效果。
丁香园：科维思也是我国最早研发数字 PCR 的创业公司之一，具有芯片研发的核心技术，旗下的产品也已经进入了监管部门的绿色通道。那对于这类产品的上市，您有怎样的期待和展望呢？
徐兵河教授：第一点，这个产品的上市为临床医生和病人提供了一个新的选择。临床的需求是多方面的，一方面可能需要更深的 NGS 检测，另一方面也需要数字 PCR 的应用。第二点，一个产品的临床应用还需要开展更多的临床研究，这是非常重要的。上市以后只有开展一些临床研究，临床医生才能对这个产品比较了解，如果医生觉得它意义非常大，病人也感觉省了钱，并且达到了监测治疗疗效、判断预后的作用，就能使数字 PCR 的推广、应用更方便，这也是非常重要的。第三点，从公司方面来说，应该对产品的优势、作用进行广泛的宣传，特别是要多跟临床医生沟通，从而让大家对这个产品了解更深。因为现在液体活检的公司以及液体活检的检测方法非常多，怎样从如此之多的检测方法中，使大家相信这个方法的确能够定量、定性、精准、方便，并且还节省费用，这需要一个过程，所以后期的推广应用也非常重要。
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王洁教授在肺癌领域具有丰富的临床经验，正在与科维思合作进行临床研究，关于数字 PCR 这项新技术在肺癌中的应用及前景，她也带来了自己独到而有价值的分析与看法。
【专家对话｜丁香园采访王洁教授内容详情】
丁香园：肿瘤疾病其实是一个非常复杂的发病过程，而活检技术可以为肿瘤的诊疗提供很多的信息，您是怎样评价组织活检和液体活检在指导肿瘤诊疗及监测疾病变化过程当中的作用？从趋势上看，液体活检是否有可能会替代组织活检的应用呢？
王洁教授：现在精准诊断是非常重要的，在精准治疗时代，无论靶向治疗还是免疫治疗都需要通过标记去选择人群，但这个过程中组织的检测依然是金标准。无论是在靶向治疗的预测，还是免疫治疗的预测上，组织依然是金标准。但是在临床中的确有一部分患者可能拿不到足够的组织标本去做基因的分析，或者它取材的质量不够或不好等，诸多原因导致我们不能一条路走到黑，必须要另辟蹊径，多种生物标本共同应用，这样才能拓展精准诊断。所以在这个理念下，我们这些年一直在探索血液里的液体活检，不光是血液，包括胸腔积液甚至尿液等，国际、国内包括我们中心都在做一些研究。
目前来看，如果以肺癌的 EGFR 突变为一个靶基因的话，那血液里即 ctDNA 里的 EGFR 突变检测率，如果以组织作为金标准，血液里的特异性就非常高，这意味着假阳性率很低，一旦检测出来就可以直接指导我们的事件。液体活检的敏感性可能在目前的技术平台下还有上升空间，既往的报道大概在 50%、80%。现在在一些新的技术平台下——数字 PCR、NGS 多基因的检测——这些平台陆陆续续通过标准化进入临床以后，相信敏感性会得以提高。如果敏感性能够控制在 90%，特异性目前在 90%、95% 以上，能保持特异性不明显降低，同时提高敏感性，那么就能两全，我相信它将成为一种更重要的方法。
目前我们的定位是，如果没有组织检测时，液体活检将作为一种补充。至于未来它能不能替代组织活检？我不喜欢用替代这个词，而应该是互相补充。每一种生物标本，包括组织、血液、血液里的 DNA、CTC、RNA 以及 Exosome 等，它们互相之间可能有一部分不重叠，所以应该是一个互补的关系。当一种标本检测出来是阴性，而又特别想做靶向治疗或免疫治疗时，不妨用另外一种标本再去验证一下。所以说没有谁替代谁，每种检测都有自己的位置。
但从另一个层面，动态监测对于组织标本来说就更难了，并且疾病进展时可能是个全面的进展，这时取一点某个部位或脏器的组织标本，往往不能替代整个疾病进展中各个部位的分子特征，所以在监测方面血液标本可能更胜一筹。原发灶、转移灶等不同病灶之间凋亡的 DNA 都会释放到血液中，因此血液能更好地反映肿瘤的分子特性、更好地克服小标本所导致的异质性。所以在耐药监测方面，我觉得 ctDNA 可能更有用武之地，但现在的问题是需要一些很好的检测平台去支撑、去动态地检测，来实现对耐药的监测和管理。
丁香园：在肺癌患者 ctDNA 检测有很多技术手段，如 PCR、NGS、ARMS，相较于后面两种，您觉得数字 PCR 在哪些临床领域是更能够解决问题的？
王洁教授：数字 PCR 的亮点是它的检测限很好，能够满足我们临床的需要，一般是千分之一，并且它可以实现绝对定量，因为基因蛋白含量与丰度和疗效也有关系，这是它的两大特点。但是不足之处是数字 PCR 只能做单个基因的检测，它不能同时做多个基因。而现在大家对异质性的理解，无论是在基线（就是没有治疗过的病人），还是治疗以后耐药的病人，有些病人不是单一基因的问题，或许是多个基因的问题，这时就需要多个基因的平台比如 NGS 会更好。所以基于数字 PCR 的优点，如果我们明确了病人是以一个驱动基因为主，如 EGFR 是一个纯的 EGFR 突变，这时用数字 PCR 去做动态的监测就比较好，也不浪费资源。但如果已经是个异质性的肿瘤，除了 EGFR 突变它还含有其他突变，这时数字 PCR 可能就不能涵盖整个基因的改变，用 NGS 这种平台会更好。所以各有优势，在不同疾病的不同阶段以及不同亚型之间，需要选择不同的监测方法及技术平台。
丁香园：对于肺癌患者来说，肺癌的复发和转移经常会导致治疗的失败，在监测肺癌的发生发展方面，数字 PCR 扮演着怎样的角色，相较于其他的技术又有怎样的优势呢？
王洁教授：数字 PCR 是一个定量的检测手段。当我们拿到肿瘤组织标本，并且这个病人既往是以单基因变异为主，这时再动态监测基因的改变。比如 EGFR 突变，有没有相应的 T790M 或者其他的非经典突变，非经典突变也不能用数字 PCR，它只能做 EGFR 敏感的 18、19、T790M 三个位点的检测。这意味着如果我们考虑它跟 T790M 突变有关系，这时我们可以去做数字 PCR，看有没有分子耐药及早期的复发。所以我觉得数字 PCR 最大的局限性是单一，但最大的优点是检测的敏感性和定量的特征。需要看定量的时候，即需要看是开始的 T790M 还是耐药后的 T790M 时，用数字 PCR 去监测还是很有意义的。
丁香园：除了定量的优势之外，数字 PCR 在时间成本上相较于其他检测手段有没有优势？
王洁教授：检测的周期在三天左右比较好，但是最近我们有个很有挑战的研究，要大概 7 个工作日，我觉得太长了。所以时间成本上还需要优化，数字 PCR 我觉得一两天、两三天就能出结果，未来还需要优化这个流程。
丁香园：您作为科维思数字 PCR 动态监测肺癌患者 EGFR 突变临床试验的主要研究者，在试验当中认为科维思产品的表现怎样？
王洁教授：我们现在刚开始做研究，还是要等待数据。但对于这个公司，它的严谨性、科学性、创新性等都还是不错的，并且他们也与时俱进，在这个研究的基础之上，他们也知道二代测序非常重要，所以在用数字 PCR 检测出来 T790M 阴性的患者，他们会推荐用 NGS 来做检测，我觉得这个非常人性化和与时俱进，对研究也是锦上添花。
丁香园：在试验过程当中，数字 PCR 是不是能够帮助肺癌患者改善预后及生存状态？
王洁教授：当然希望是如此的。它是一个申请药监局注册的研究，结果出来后，就能更好地推广、更好地为肺癌患者服务，我觉得前景应该非常好，具有重大的社会经济效益。
丁香园：您对科维思这类的企业，对他们未来的发展有怎样一些建议？
王洁教授：数字 PCR 的确是一个非常敏感、定量的检测平台，但是作为一个公司来说只有一个技术平台是不够的，尤其在这个时代，对肿瘤的了解越来越深入，包括从初始到治疗过程中对遗传学的改变也了解得越来越多，并且药物也越来越多，需要更多在精准检测基础之上的精准管理。对这个公司来说应该往 NGS 甚至三代测序的方向，一方面去研究数字 PCR，另一方面后续做补充和完善的平台还是需要去探寻，否则数字 PCR 应用还是有一定的局限性。有些异质性强的病人可能用数字 PCR 就不合适，这时候就需要更大的平台监测，所以他们应该要进一步去探索。
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此次卫星会的主办方科维思是国内较早一批做数字 PCR 产品的公司，王焱博士作为科维思 CEO，也与我们分享了科维思产品的进展以及数字 PCR 应用的成果、创新点和计划期望等诸多干货。
【CEO 对话｜丁香园采访王焱博士内容详情】
丁香园：科维思一直致力于做肿瘤液体活检相关的产品，从早期的 NGS 产品到现在的芯片式数字 PRC。去年芯片式数字 PRC 的设备就已经获批，目前试剂注册方面有哪些新的进展呢？
王焱博士：我们第一批注册的是 EGFR T790M 突变检测试剂盒和 HER2 扩增的试剂盒（数字 PCR 法）。目前注册进展最快的是检测 HER2 扩增的试剂盒，前段时间药监局已经过了一遍审评，目前正在资料发补的阶段。按照药监局的说法，这个试剂盒获批后将是全球第一款用数字 PCR 法来检测基因扩增的产品。
EGFR T790M 突变检测试剂盒我们和医科院肿瘤医院的王洁教授合作。她是我们这个产品注册临床试验的 PI。给了我们很多的支持和帮助。我想这个产品也有希望成为第一个完成临床试验，申报的药监局的伴随诊断试剂。
除了这两个注册产品，我们还开发了 20 几种针对常见肿瘤突变的检测试剂盒，比如 KRAS，BRAF，PIK3CA 等这些比较著名的基因。目的是配合 NGS，针对病人个性化的肿瘤突变在治疗的过程中进行动态检测。这个技术的组合，和传统的影像学相比，通常会提前几个月看到病人耐药，提示医生调整治疗方案，延长患者的无进展生存期。这个是能够让肿瘤病人延长生命的有效手段，也是非常新的应用。我们期待和临床专家一起，去尽快地积累足够的数据，完成这些产品从科研用到合规的临床应用的路径。
丁香园：与传统的 HER2 检测方法相比较，芯片式数字 PCR 有什么优势，或者说有什么创新性呢？
王焱博士：从应用方面讲，针对乳腺癌、胃癌病人，数字 PCR 检测 HER2 基因的扩增可以替代组织里的 FISH 或 IHC 这些传统的检测方法。它核心的创新点是脱离了形态学的一套东西，相当于我们直接看的就是核酸层面，我们数出来的是在样品里 HER2 的绝对拷贝数，而不是看蛋白表达的情况，或者是 FISH 看 HER2 和中心粒相对的扩增，所以我想这应该是一个更加客观的结果。
从操作层面，芯片式数字 PCR 操作真的会容易很多，而且检测结果与传统金标准的一致性也相当不错。在我们的临床试验过程中，数字 PCR 上手的时间从 DNA 的纯化到最后结果的读取只有 3-4 个小时，今天做实验明天就可以拿到结果。通常 IHC 和 FISH 要经过各种处理，这需要 1-2 周的实验周期，从检测速度这一点来说对于医生是很有价值的事情。而且从病理医生的角度来说，数字 PCR 是看扩增基因与内参基因的一个比值，结果很客观、呈现也很方便，病理科的医生可以不用花大量时间在暗房里面盯着几个很亮的荧光点去数数，这也是一个很幸福的事。我们也希望这个产品能够尽快的更好地帮助患者。
丁香园：科维思与许多的资深专家就数字 PCR 的临床应用方面开展了一系列的合作，关于 HER2 检测有没有一些最新的进展可以和大家做个分享？
王焱博士：我们 HER2 的这个产品最终是要应用于外周血检测的。虽然我们现在申报的是组织上的检测应用，但是外周血的应用最早我们是和上海仁济医院的乳腺专家，还有检验领域的一些专家共同合作，拿到了第一批的实验数据。最让人觉得鼓舞的一件事情是，数字 PCR 得到的这个结果和疗效的相关性是最好的。当我们看病人的生存曲线的时候，以数字 PCR 为标准评判阳性和阴性，和 FISH 去作比较，它的那个区分是最大的。所以这也说明数字 PCR 的特异性非常得好，它会真正筛选出来能够获益于治疗的一个群体。接下来我们会把类似的研究也拓展到复发转移的乳腺癌患者里面，也就是说会不局限于初诊的病人，我们会做到复发转移，对于晚期病患在治疗过程中的动态监测，这也是液体活检独有的优势。这项研究者实验，我们和医科院肿瘤医院的徐兵和，袁芃两位教授已经开始了合作，正在招募更多的临床中心参与。
丁香园：目前科维思的芯片式数字 PCR 产品线主要集中在肿瘤领域这一块，将来是否有一些其他的业务线条的扩充，比如说无创唐筛或者血液病、病原微生物相关的检测？
王焱博士：关于 NIPT，有的专家会认为数字 PCR 做不了无创产前，那么我的理解是如何来定位这个产品。如果只是把它放在孕早期的时候，它的检测灵敏度确实是达不到要求。但是因为它检测时间短而且简单方便，所以对于孕妊娠晚期的那些母体内胎儿游离 DNA 含量很高的孕妇，数字 PCR 在灵敏度上是可以满足需求的。第一天采血做检测，第二天就能拿到结果。如果真的需要做穿刺还是一天出结果，而不是像传统的穿刺需要前前后后等上 1-2 周，甚至更久。与二代测序加穿刺看核型的组合检测周期相比较，相当于给病人前后节约了 1-2 个月的时间，对于妊娠晚期的病人来讲是非常有价值的。所以我想这是它在无创产前应用的一个潜在优势。
血液病的检测方面，如白血病的一些融合基因的检测，包括各种病原微生物、病毒的检测，实际上都需要一些更灵敏的检测手段。比如病毒的检测，通常是在治疗过程中大家希望看到这个病毒彻底消失，那么现在的检测方法可能只有一千个拷贝以下，第一没法绝对定量，第二灵敏度也达不到。目前什么时候停药往往就是医生和患者共同的困惑。数字 PCR 因为它可以检测到 5-10 个拷贝，而且稳定性很好，所以未来在这里面也会有很多很好的延伸。
丁香园：在您看来目前芯片式数字 PCR 在成本、自动化和通量等方面，将来可以提升的空间是什么样的，或者说怎么样能够更加满足临床诊疗的诉求？
王焱博士：现在数字 PCR 确实有一个成本的问题，这个成本其实不仅仅是生产的原材料和人工的成本，它更多的是前期研发的成本。在我们研发过程中需要做各种事情，进行大量的实验验证。从产品注册的角度来说，因为是新产品所以相对于传统的成熟产品我们需要做得更扎实，它的研发投入会非常高。所以早期均摊到我们新上市的产品成本里面，它会有一定的门槛。但是从长远来讲，随着我们的产品线逐渐丰富，应用逐渐拓展，我相信价格会变得更有亲和力。
目前数字 PCR 临床应用是低通量的，将来我很希望能够把它做成一个中高通量的床边的应用。因为它检测的灵敏度高，这种相对低通量的产品整个的反应时间短，所以我们一天可以做多轮的检测。从这个角度来说，这种中高通量的床边的应用是下一步发展的方向。后续如果数字 PCR 真的能拓展到像现在的 ELISA 或者是化学发光的应用的话，因为一旦用到动态监测，它的数量是很大的，市场也是非常大的。那我相信到那个时候会应运而生一些真正高通量的设备来满足这样的检验需求。
数字 PCR 确实是一个有明确临床价值的创新产品，未来有良好的发展前景但也还有一段路要走，希望南京科维思能够在将来发展得越来越好，也非常感谢徐兵河教授、王洁教授和王焱博士在百忙之中接受我们的采访。
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