Plexin A1在胃癌中的表达及其与肿瘤细胞增殖和血管生成关系的研究

赵向阳，陈凛，中国人民解放军总医院普通外科 北京市 100853
许倩，承德医学院基础医学研究所 河北省承德市 067000
李玉红，承德医学院病理教研室 河北省承德市067000
通讯作者：陈凛，100853，北京市复兴路28号，中国人民解放军总医院普通外科。chenlinbj@vip.sina.com
电话：010-66937846 传真：010-68181689
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30570522）

[摘要] 目的：探讨PlexinA1在胃癌中的表达及其与肿瘤细胞增殖和血管生成的关系。方法：应用RT-PCR检测20例胃癌患者的癌组织及胃切缘正常胃黏膜Plexin A1的mRNA表达；免疫组织化学方法检测50例胃癌组织和20例胃正常黏膜中PlexinA1、Ki-67、VEGF和第Ⅷ因子（微血管密度MVD）的表达。结果：PT-PCR示胃癌组织中的PlexinA1mRNA的表达明显高于胃正常黏膜（0.71±0.37vs0.60±0.25，P=0.0299＜0.05）。胃癌组织中MVD随着PlexinA1mRNA表达（r =0.8736, P＜0.01）和蛋白表达(P＜0.01）的增高而增高；肿瘤细胞增殖指数Ki-67的表达与PlexinA1存在明显相关性（r =0.4851, P＜0.01）；而VEGF的表达与PlexinA1的表达无关。结论：PlexinA1在胃癌发生发展中发挥重要作用，与调节血管生成和促进肿瘤细胞增殖有关。
[关键词] PlexinA1； 肿瘤细胞增殖； 血管生成；胃癌

The expression of Plexin A1 in gastric carcinoma and its relationship with tumor angiogenesis and proliferation

ZHAO Xiang-Yang, CHEN Lin, XU Qian, LI Yu-Hong
ZHAO Xiang-Yang, CHEN Lin, Department of General Surgery, General Hospital of Chinese PLA, Biejing 100853, China
XU Qian, Institute of Basic Medicine, Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei province, China.
LI Yu-Hong, Department of Pathology, Chengde Medical College, Chende 067000, Hebei province, China.
Corresponding author: Professor Chen Lin, Department of General Surgery, General Hospital of Chinese PLA, 28 Fuxing Road, Biejing 100853, China. chenlinbj@vip.sina.com
Telephone: +86-010-66937846, 13801290395 Fax: +86-010-68181689
[Abstract] Objective: To investigate the expression of PlexinA1 in gastric carcinoma and its relationship with angiogenesis and proliferation of human gastric carcinoma (HGC). Methods: PlexinA1 mRNA expression in 20 cases of HGC specimens obtained by surgical resection from patients with HGC were examined by RT-PCR. PlexinA1, Ki-67, VEGF protein expression and microvessel density (MVD) in HGC specimens were detected by immunohistochemistry. Results: RT-PCR showed the expressions of PlexinA1 in HGC were significantly higher than those in normal gastric mucosa（0.71±0.37vs0.60±0.25，P=0.0299＜0.05）. MVD within tumor tissues increased significantly with PlexinA1 mRNA expression（r =0.8736, P＜0.01）and PlexinA1 protein expression (P < 0.01). The PlexinA1 expression was positively correlated with the proliferation index （Ki-67） of cancer cells（r =0.4851, P＜0.01). However the PlexinA1 expression levels have no relationship with the VEGF expression levels. Conclusions: PlexinA1 play important roles in the occurrence and development of HGC. PlexinA1 may regulate angiogenesis, and promote the proliferation of HGC cells.
[key words] PlexinA1; Tumor cell proliferation; Angiogenesis; Gastric carcinoma

引言
PlexinA1作为Semaphorins的主要受体，是一个具有多向潜在功能的跨膜蛋白，在神经系统形成、心血管生成、胚胎发生和免疫反应等方面发挥重要作用[1-4]，然而，目前对PlexinA1功能及作用机制了解仍然较少，尤其在肿瘤方面的研究未见报道，本研究首次通过RT-PCR和免疫组织化学方法研究Plexin A1在胃癌及其正常黏膜表达并探讨其作用机制。

材料和方法
一、 RT-PCR检测PlexinA1 mRNA的表达
1． 病例选择
收集解放军总医院2006年4月至2006年8月期间手术切除的20例胃癌患者的胃癌组织及远离癌肿胃切缘正常黏膜。患者术前未接受化疗和放疗。全部病例均经手术和病理证实。20例患者男12例，女8例；年龄32-74岁，平均（54±15）岁。肿瘤分化程度：高、中分化腺癌9例，低分化腺癌11例。区域淋巴结转移阴性者13例，阳性7例。新鲜组织离体后迅速提取总RNA，-70℃储存。
2． 半定量RT-PCR
2．1提取总RNA及逆转录
用Trizol（博大泰克公司）提取总RNA，溶于40μlDEPC处理的双蒸水中，混匀，在核酸蛋白测定仪上检测总RNA浓度。20μl逆转录体系中加入1.5μg总RNA，用M-MLV第一链cDNA合成试剂盒（博大泰克公司）逆转录，按试剂盒说明书操作步骤进行。
2．2扩增及电泳
取2μl逆转录产物作模板，选用即用PCR扩增试剂盒（博大泰克公司）在PCR仪上进行PCR扩增。以ß-actin作为外参照。ß-actin和PlexinA1引物由华大基因合成。PlexinA1引物序列：上游5’-TGTGGACGACCCCAAATTCTA-3’，下游5’-CTGGGCAAACACGGTGAAC-3’。ß-actin引物序列：上游5’-ACACCTACCAGGGAACGGAG-3’，下游3’-GCCTCTGCACATACCTGCT-5’。PCR反应体系50μl，PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性50s，55℃退火50s（β-action 56℃50s），72℃延伸1min，37个循环，72℃再延伸8min。取8μlPCR产物在2.0%的琼脂糖凝胶上电泳30min，溴乙锭染色。将PlexinA1与ß-actin的灰度值的比值作为PlexinA1 mRNA的相对表达水平。
二、免疫组织化学方法检测PlexinA1、Ki-67、VEGF和第Ⅷ因子。
1．病例选择
收集解放军总医院2006年1月至2006年8月期间手术切除的50例胃癌患者的胃癌组织石蜡切块及20例胃切缘正常黏膜的石蜡切块（其中包括20例上述做RT-PCR的病例）。肿瘤分化程度：高、中分化腺癌23例，低分化腺癌27例。区域淋巴结转移阴性者22例，阳性28例。
2．免疫组织化学
PlexinA1多克隆抗体（1：50）购自美国Santa Cruz公司。Ki-67、VEGF和第Ⅷ因子购自博士德公司（中国武汉）。所有操作按公司提供的操作步骤进行。同时阳性标本作为阳性对照，PBS作为一抗为阴性对照。
3．结果判定
在光学显微镜下观察，胞浆或胞膜染成棕黄色深浅不一的颗粒为阳性细胞。阳性标准：随机查看10个高倍视野，计算阳性细胞数所占总细胞数比例≥30%；＜30%者为阴性。第Ⅷ因子呈棕黄色，定位在血管内皮上。肿瘤微血管密度(microvessel density，MVD)测定按Weidner等[5]报道的方法进行：切片先在低倍镜(×100)下观察全片以确定肿瘤内血管密度最高处。再在高倍镜(×200)下，与周围肿瘤细胞和结缔组织成分明显分开的任何被第Ⅷ因子相关抗原染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇，都被看作一个微血管，只要结构不相连，其分支结构也作为一个血管计数。记录5个视野内的微血管数，取其平均值作为该病例的MVD值。

三、统计学分析
采用SPSS11.5统计软件对所得数据进行配对t检验、卡方检验、Spearman等级相关和直线相关分析。P<0.05 被认为有统计学意义。

结果
一、PlexinA1的mRNA表达
经RT-PCR对PlexinA1mRNA的检测，PlexinA1mRNA扩增产物为172bp， ß-actin为207bp（图1）。PlexinA1在所有的胃癌组织和胃正常黏膜中均有表达，而且PlexinA1在胃癌组织中的表达明显高于正常胃黏膜（0.71±0.37vs0.60±0.25，P=0.0299＜0.05）。但是，PlexinA1mRNA的表达与肿瘤的分化程度、侵润深度和淋巴结转移无统计学意义，与病例数较少有关。

二、PlexinA1蛋白表达
光镜下观察，PlexinA1蛋白主要定位于细胞质和细胞膜。PlexinA1在肿瘤细胞、平滑肌细胞和大部分血管内皮细胞、神经细胞中有表达，而在淋巴细胞中几乎无表达（图2a）。PlexinA1在胃正常黏膜和胃癌阳性表达率分别为25%和52%，二者相比具有显著性差异（P=0.0399＜0.05）。而PlexinA1与胃癌患者的年龄、肿瘤大小、分化程度、侵润深度和淋巴结转移无关（表１）。


三、 PlexinA1与Ki-67和VEGF蛋白表达之间的关系
光镜下观察，Ki-67蛋白主要定位于细胞核（图2b），而VEGF蛋白主要定位于细胞浆和/或细胞膜（图2c）。PlexinA1蛋白与Ki-67在胃癌中的表达有明显的一致性（r =0.4851, P=0.0006）；与VEGF无明显相关性。(见表1)
四、 PlexinA1的表达与胃癌组织中的MVD
PlexinA1mRNA在胃癌和相应的正常黏膜中表达的比值与肿瘤组织中的微血管密度（MVD）呈明显的相关性，随着PlexinA1 mRNA表达的增强肿瘤组中的微血管密度（MVD）也增高（r =0.8736, P＜0.01）。同时，免疫组化示：PlexinA1阳性表达的胃癌组织中的MVD（25.25±3.93）明显高于PlexinA1阴性表达的MVD（19.56±1.75）(P＜0.01）（图2d）。

讨论
PlexinA1属于Plexins跨膜蛋白家族，其单独作为受体或与neuropilin-1、neuropilin-2形成受体复合物，与Semaphorins结合，在神经系统的发生发展中发挥重要作用[1，6]。然而，近年来的研究发现PlexinA1是一个具有多向潜在功能的跨膜蛋白受体，尤其是PlexinA1在心血管形成中的作用引起了研究者的关注。例如， Toyofuku T等人[2，7]研究报道，PlexinA1通过与其配体Semaphorin6D结合，可诱导或抑制心脏不同部位的上皮细胞的迁移，从而在胚胎心血管的形态发生中发挥重要作用。这些研究发现提示我们PlexinA1可能在机体的血管形成，特别是在诱导肿瘤新生血管方面上发挥一定的作用。众所周知，肿瘤血管生成是肿瘤侵袭和转移的重要前提之一[8，9]。同样，胃癌的生成及其恶性侵袭和转移与血管生成也有着密切关系。本研究通过RT-PCR对PlexinA1进行检测，结果发现PlexinA1在胃癌组织和正常黏膜中均有表达，而且癌组织中PlexinA1 mRNA表达明显高于正常黏膜。提示PlexinA1与胃癌的发生发展存在着密切关系，因此，我们又通过免疫组化方法检测50例胃癌组织和20例胃正常黏膜中PlexinA1、Ki-67、VEGF和第Ⅷ因子（微血管密度MVD）的表达，对PlexinA1在胃癌中的作用进行深入的研究。结果发现，PlexinA1蛋白定位于细胞质和细胞膜，在肿瘤细胞、平滑肌细胞和大部分血管内皮细胞、神经细胞中有表达，而在淋巴细胞中几乎无表达。PlexinA1蛋白在胃癌组织中的表达明显高于胃正常黏膜，但是与胃癌患者的年龄、肿瘤大小、分化程度、侵润深度和淋巴结转移无关。Ki-67和VEGF、第Ⅷ因子（微血管密度MVD）是反映肿瘤细胞增殖和血管生成的重要指标[10-12]。本研究结果显示，PlexinA1的表达与Ki-67和第Ⅷ因子（微血管密度MVD）呈明显正相关，与VEGF的表达无关。这说明PlexinA1在促进肿瘤细胞增殖和调节肿瘤新生血管方面发挥重要作用。本研究从一个全新的角度，首次报道PlexinA1在胃癌中的表达情况及其作用机制，为深入探讨胃癌的发生发展机制奠定了基础，同时为胃癌的治疗研究提供一个崭新的思路。

参考文献
1.Pasterkamp RJ, Verhaagen J. Emerging roles for semaphorins in neural
regeneration. Brain Res Brain Res Rev, 2001, 35:36-54.
2. Toyofuku T, Zhang H, Kumanogoh A, Takegahara N, et al. Dual roles of Sema6D in cardiac morphogenesis through region-specific association of its receptor, Plexin-A1, with off-track and vascular endothelial growth factor receptor type 2 .Nature Cell Biol, 2004. 6: 1204−1211.
3. Perala NM, Immonen T, Sariola H. The expression of plexins during mouse embryogenesis. Gene Expr Patterns, 2005, 5:355-62.
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5. Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and meiastasis correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J I Med, 1991, 324:1-325
6. Murakami Y, Suto F, Shimizu M, et al. Differential expression of plexin-A subfamily members in the mouse nervous system. Dev Dyn, 2001, 220: 246-58 .
7. Toyofuku T, Zhang H, Kumanogoh A, et al. Guidance of myocardial patterning in cardiac development by Sema6D reverse signalling. Nat Cell Biol, 2004, 6:1204-11
8. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat. Med, 1995, 1: 27–31.
9. Bergers G, Benjamin LE. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat. Rev. Cancer, 2003, 3(6), 401–410.
10．Salvesen HB, Iversen OE, Akslen LA. Identification of high-risk patients by assessment of nuclear Ki-67 expression in a prospective study of endometrial carcinomas. Clin Cancer Res, 1998, 4: 2779-2785.
11．Leung DW, Cachiancs G, Kuang WJ, et al. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science, 1989, 246:1306-1309.
12．Kraizer Y, Mawasi N, Seagal J, et al. Vascular endothelial growth factor and angiopoietin in liver regeneration. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 287:209-215.


图2.Plexin A1, VEGF, Ki-67 and Ⅷ factor在胃癌中的表达. A: Plexin A1 (S-P×400); B:VEGF (S-P×400); C: Ki-67 (S-P×400); D: Ⅷ 因子 (S-P×400)