肝癌检测还在依赖甲胎蛋白？ 中国技术有了更精准方式

这项中美合作研究发现，通过检测少量（4～5 ml）外周血中循环肿瘤 DNA（ctDNA）特定位点的甲基化水平，可以对肝癌进行准确的早期诊断及疗效和预后预测。

这一成果可望打破肝癌长期单一依赖甲胎蛋白（AFP）检测的困境，提供全新的高灵敏度的检测标志物。

图 研究论文截图 

如何检测肿瘤？

抽血实现，无创、实时、全面、准确

研究发现，肿瘤患者外周血中可检测到肿瘤细胞坏死、凋亡所释放的 ctDNA，由于其携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变，理论上可以利用 ctDNA 对肿瘤进行诊断。

与经典的组织活检技术相比，液体活检技术具有以下优点：

• 无创性，仅凭少量外周血标本即可完成检测，不会引起肿瘤播散；

• 实时性，可动态反应肿瘤细胞的遗传改变和演变进程，避免反复有创的组织活检；

• 全面性，反映的是体内肿瘤细胞的分子遗传信息的全貌，避免了瘤内异质性对组织活检结果的影响；

• 准确性，其所携带的分子遗传学信息来自原发肿瘤，具有高度敏感性和特异性。

如何测出肿瘤？

ctDNA 甲基化，肿瘤液体活检新靶标

在最近发表的这项成果中，研究者选择了 ctDNA 甲基化， 作为液体活检的靶标。

DNA 甲基化是 DNA 重要的修饰途径之一，在 DNA 甲基化转移酶 ( Dnmt ) 作用下将甲基选择性添加到胞嘧啶上形成 5-胞嘧啶的过程，可调控基因的表达。

研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞基因组的整体甲基化水平降低，抑癌基因启动子 CpG 岛甲基化水平升高。在同一类型的肿瘤细胞中可检测到稳定和一致的特征性 DNA 甲基化改变，DNA 甲基化作为肿瘤发生过程中的早期分子事件之一，常导致相应的抑癌基因失活，因此可作为潜在的肿瘤早期诊断的理想标志物。

但是，ctDNA 在血液中的含量极微，每毫升血中仅有约 20ng ，且混杂在更大量的正常游离 DNA 背景中，在如此微量的 ctDNA 中检测单个碱基的甲基化水平存在很多困难。

在这项新发表的工作中，研究者先后攻克了稳定提取微量 ctDNA 、提高重亚硫酸盐转化效率、靶向甲基化 PCR 扩增及测序、海量数据的统计学分析处理等多个技术壁垒，成功地在肝癌患者中实现了检测 ctDNA 甲基化作为早诊和随访及预后预测标志物的目标。

检测准确度如何？

敏感性和特异性明显高于现有肝癌血清标志物

研究者首先在全基因组水平上从肝癌组织和正常血液 DNA 的 4 85,000 个 CpG 位点甲基化中筛选出差异性最显著的位点；设计相应的锁式探针（ Padlock probe），对近两千例肝癌和正常人血浆中提取的微量 ctDNA 进行了甲基化 PCR 扩增和测序。

确定了这些位点的甲基化水平后，通过大量的统计学分析和计算，并利用多种人工智能模拟的机器学习方法，最后分别筛选出 10 个和 8 个位点建立了诊断模型和生存预后模型。    

该诊断模型在训练组 715 例肝癌患者和 560 例正常人中的诊断敏感性和特异性分别达到了 85.7% 和 94.3% ，在验证组 383 例肝癌患者和 275 例正常人中的诊断敏感性和特异性分别达到了 83.3% 和 90.5% ，均明显高于现有肝癌血清标志物 AFP ，并能准确区分肝癌患者和慢性肝炎（ HBV/HCV ）和脂肪肝患者，显示出在肝癌早期诊断中的巨大价值。

此外，该模型还能准确反映肝癌患者的 TNM 分期、体内有无肿瘤残留、对治疗的反应以及有无复发等。而对 1049 例生存资料完整的肝癌患者，依据生存预后模型进行评分，低风险组患者的预后显著优于高风险组患者，显示出利用该模型可以准确预测肝癌患者的预后，有利于对不同的风险的患者进行更为个体化的治疗。

图 ctDNA 甲基化诊断模型在训练组（左）和验证组（右）人群中的诊断敏感性和特异性

图 用于构建诊断模型 10 个 CpG 位点在训练组（左）验证组（右）患者 ctDNA 中的甲基化水平 Heatmap 图

图 ctDNA 甲基化诊断模型诊断肝癌的 AUC（0.969）显著优于 AFP（0.816）

图 训练组 680 例 （左）验证组 369 例 （右） 不同生存风险评分的患者预后具有显著差异

我国是肝癌大国，全世界每年超过一半的新发肝癌病例都在中国。甄选高灵敏度的早诊和随访标志物对于提升肝癌整体疗效意义重大。

ctDNA 甲基化液体活检技术的成功，标志着我国在液体活检这一最具发展潜力的肿瘤无创诊断手段领域已经与国际比肩，我们期待这一技术尽早推向临床，造福广大肝癌患者，尤其是亚临床期的早期肝癌患者。

图 徐瑞华教授与研究团队部分成员

图 Kang Zhang 教授与研究团队部分成员

编辑｜刘敏、小辉

封面图摄影 | 羊角丫丫

本文转自丁香智汇公众号(dxywisdom）