肺癌是世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤，近20年来，我国肺癌导致的死亡超过癌症总死因的20%。由于早期肺癌的临床症状不明显，80%的肺癌患者就诊时已属中晚期，其中50%以上患者不能手术且5年生存率仅有10%。改善预后的关键就在于早期发现、早期诊断。呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）检测具有无创伤、简单易操作、可反复进行等优点，其中某些成分的显著变化可以反映肺内及气道内的病理生理状态，有望成为高危人群筛查早期肺癌及辅助肺癌早期诊断、病情监测及疗效判断的新型手段，但是目前仍处于探索阶段，尚有很多未解决的问题。
1 EBC检测的概况
平静呼吸时，呼出气体通过特殊的冷凝装置形成液态，即为EBC。用于EBC收集的装置主要有3种：一为美国生产的RTUBE便携装置，中间置一聚丙烯管，冷凝后的液体可附于内管壁；二为德国埃里希积有限公司生产的Ecoscreen电动制冷装置；另外国内也有自制冷凝装置的报道。皆包括一含单向阀门的制冷管，可将吸入气和呼出气分离，防止反复吸入呼出气，且采集时要求受试者漱口，带鼻夹排除鼻腔，鼻安所产生物质的干扰，有唾液时嘱其咽下，咳嗽时需暂停收集。受试者经口呼吸10～15 min，冷凝器中可收集1～3 ml冷凝物，收集标本需通过检测其中淀粉酶的含量来确定是否存在唾液的污染。与传统检测手段相比，EBC检测具有真正完全无创、瞬时、可实现动态监测、适用人群更广等优势。
EBC为一种高度稀释的体液，通过特殊的、高度敏感的检测方法可测到一些挥发性物质（如一氧化氮、一氧化碳等）、非挥发性物质（如亚硝酸盐、氨及有血管活性的胺类物质）、蛋白质、多肽、核酸及一些脂类代谢物等。研究报道在EBC中可以检测到数千种物质，且不断有新的物质被检测到，它们主要来自下呼吸道内衬液，推测认为是呼吸气流形成“气旋”将气道内衬液“刮落”或是吸气时气道扩张形成的张力将表层液相“撕裂”所致。这些物质可随疾病及治疗干预等而改变。通过对EBC中的这些生化分子（一般相对分子质量小于65 000）或pH值等参数的变化进行检测，可反映氧化损伤、炎症等气道状态。
对于EBC检测的研究主要集中于采用病例一对照研究或横、纵向研究方法等进行EBC中可检测因子及pH等的研究，为应用于临床诊断、鉴别诊断提供实验依据；寻找影响EBC检测的可能因素，如收集设备、收集方法、检测方法等来进行EBC检测标准化方面的研究。目前国内外研究较多的是EBC中的炎性标志物，如过氧化氢、一氧化氮及其相关产物（硝酸盐/亚硝酸盐）、前列腺素、白三烯等，这在气道炎症的I监测和治疗方面有着重要的应用价值。许多学者通过研究发现在EBC中寻找肺癌特异性的肿瘤标志物及联合多种标志物来进行肺癌诊断对肺癌的筛查、早期诊断、病情监测及预后判断也有着重要的应用意义。
2 肺癌患者EBC中可检测的主要因子及其意义
肺癌的形成是一个多阶段、多步骤、多基因参与的过程，在不同阶段相继或同时有不同基因或细胞因子等的改变。目前关于EBC中肺癌标记物检测的研究越来越多，主要分为特异性标记物和非特异性标记物，前者包括氧化应激或炎性标记物等，后者主要包括肿瘤血管生成及基因突变等相关的标记物等。
2.1 氧化应激标志物 研究表明氧化应激引起体内氧化剂与抗氧化剂水平失衡，进而导致脂质过氧化是肺癌发生、发展过程中的一个重要步骤，8-异前列腺素、过氧化氢可作为体内氧化应激的量化指标。1994年Khyshiktyev等研究提出肺癌患者EBC中脂质过氧化产物水平低于正常人群。后有研究表明，以健康吸烟者为对照，肺癌患者血清中8-异前列腺素的水平是增加的，且在进展期肺癌中升高更明显，而在肺癌患者EBC中其水平无升高，且与临床分期、年龄等无显著关联。另有学者对21例非小细胞肺癌患者、21名非吸烟健康者、13名曾吸烟者、16名现吸烟者EBC进行检测，发现肺癌患者EBC中8一异前列腺素、过氧化氢水平明显高于吸烟人群。脂质过氧化产物在肺癌患者EBC中的水平变化尚存在着争议，且氧化应激与多种疾病均密切相关，因此其量化指标在肺癌早期诊断及病情监测应用中尚需进一步探索。
2.2生长因子/内皮素 内皮素-1是由21个氨基酸组成的多肽，具有调节有丝分裂和血管舒缩等能力。肺动脉内皮细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞皆可分泌大量内皮素，刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞等的增殖，参与肺癌的发生、发展。Carpagnano等研究发现在大部分非小细胞肺癌细胞株中可检测到水平升高的内皮素-1，并检测了30例肺癌患者EBC中内皮素-1的水平，与健康对照组相比，其水平是显著增高的，且与肺癌分期呈正相关，且Ⅰ期肺癌患者在手术后，EBC中的内皮素-1水平也相应下降，从而初步推断EBC中内皮素-1可以作为一种肺癌早期诊断的标志物，也可应用于对肺癌的病情监测。
另外，Carpagnano等还研究发现非小细胞肺癌患者EBC中白介素2、白介素6的水平是显著增高的，但是这些炎性细胞因子的特异性不高，可伴随机体创伤、炎症和肿瘤等多种病变。有研究提出内皮素-1水平的增高也可出现在肺动脉高压、肺纤维化患者及炎性肺疾病患者的EBC中；白介素6的水平在慢性阻塞性肺疾病、哮喘患者EBC中显著增高，因此这些生长因子类的标志物在单独应用于肺癌时具有局限性。当出现结果不一致时，应该与其他肺癌标志物联合应用进行分析和研究，进而为其在肺癌早期诊断等方面的应用提供更多的实验依据。
2.3血管生成相关因子 研究证实血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等多种活性物质参与调节肿瘤血管生成，可作为肿瘤特异的分子标志物。2008年Gessner等研究提出与健康人群和慢性阻塞性肺疾病患者EBC中血管相关因子水平相比，非小细胞肺癌患者EBC中VEGF、bFGF、血管生成素的水平显著增高，但与肺癌分期、解剖学和组织学类型无显著关联。经过2次化疗后（肿块直径至少减少25%）的患者，EBC中血管相关因子的水平显著下降，初步认为通过检测EBC中血管相关因子的水平对指导肺癌治疗及监测治疗反应具有重要的意义，但仍需要进行大规模的基础和临床研究来提供实验依据。
2.4核酸在肺癌发生与发展过程中，大量癌变的支气管或气道上皮细胞的DNA可直接脱落到呼吸道内衬液中，推测在EBC中进行基因表达分析用于肺癌早期诊断是具有可行性的。目前热点主要集中于在EBC中探寻特异性的微卫星改变位点、检测p53基因突变及基因启动子甲基化状态等。
2.4.1 微卫星改变 Hung等发现在肺癌患者的3p14、3p21和3p25等部位出现频繁的等位基因特异性丢失。Miozzo等应用PCR结合微卫星分析法发现在3p21、3p24和3p25等部位出现微卫星不稳定性。因此测定3p位点微卫星改变对肺癌的诊断有一定的价值。2005年Carpagnano等收集30例非小细胞肺癌患者和20名健康受试者的EBC和全血，提取DNA并检测3p区域的5个微卫星位点 （D3S238、 D3S1266、 D3S1300、 D3S1304、D3S1289），发现在非小细胞肺癌组中，53%的EBC-DNA和10%的全血-DNA中可检测到微卫星改变，而在健康对照组，13%的EBC- DNA和2%的全血一DNA中可检测到，说明在探寻肺癌特异的微卫星改变中，EBC-DNA具有更高的敏感性，另外结果还显示在肺癌患者EBC-DNA中微卫星改变数目与受试者吸烟量直接显著相关，提示该手段可在对高危人群进行肺癌筛查和诊断等方面具有一定的应用价值。
随后Carpagnano等又证实了对非小细胞肺癌患者EBC-DNA 3p区域中微卫星位点分析的结果与相应肺癌组织中的分析结果具有一致性，通过检测EBC-DNA可以反映体细胞的突变。另外研究发现EBC中3p区域微卫星改变的数目与非小细胞肺癌患者的预后显著相关，其中D3S1289位点杂合子丢失与肺腺癌患者预后呈负相关，而D3S2338位点的杂合子丢失则影响肺鳞癌患者的预后。有研究表明ERCC是核苷切除修复通路的限速酶，也参与到肺癌的发生、发展中。基于此，Carpagnano等对34例非小细胞肺癌患者、33名健康志愿者（19名非吸烟者，14名吸烟者）进行研究，检测来自EBC和全血的DNA的19q区域2个微卫星位点：D19S908（ERCC-1基因座点）和D19S393（ERCC-2基因座点），并对其中25例肺癌患者进行随访研究，结果显示在健康非吸烟者EBC和全血DNA中未检测到微卫星改变；健康吸烟组和非小细胞肺癌组各有16%和25%的EBC-DNA可检测到微卫星改变；EBC-DNA的微卫星改变率与受试者吸烟量及患者预后有关（D19S393杂合子缺失与预后密切相关），与肺癌组织类型无关。
虽然被检样本数最较少且研究尚处于早期阶段，还需进一步深入研究，但研究人员认为，在肺癌患者EBC中可检测到微卫星改变，其阳性率显著高于健康对照，且阳性检出率高于全血，对肺癌的早期筛查、诊断及病情监测随访具有可行性。
2.4.2 突变型p53基因 大量究表明，p53基因中热点突变密码子的出现与烟草中的多环芳香烃类致癌物（如苯并芘等）有关，检测p53基因突变可以反映癌前病变的损害程度，提示在EBC中检测p53基因突变点对于高危人群筛查早期肺癌具有一定的特异性。2004年，Gessner等招募18例非小细胞肺癌患者（皆为吸烟者）和18名健康志愿者（4名已戒烟5年以上，余为非吸烟者），收集EBC，提取DNA，采用巢式PCR实验扩增p53基因的第5外显子至第8外显子并测序进行观察，发现11例非小细胞肺癌患者中有4例存在p53基因突变（36.4%），健康志愿者中未检测到p53基因突变；且发现在EBC中检测到的p53基因突变情况与在相应组织中检测到的突变情况不一致，研究者认为这可以用区域性癌变来解释，EBC可以反映气道及肺实质的整体情况，而活组织检查因取材的局限性，仅能反映局部癌变情况。同时发现存在支气管不典型增生的患者EBC中可检出突变的p53基因，p53蛋白阳性的不典型增生细胞同时有p53基因突变，倾向于维持其不可逆性的不典型增生，部分发展为鳞癌。因此推测在EBC中检测p53基因监测肺癌是可能的，但有待进一步研究，应用于临床尚有差距。
2.4.3 DNA甲基化有实验证明启动子超甲基化可直接或间接阻遏转录的进行；也可通过5-甲基胞嘧啶脱氨基诱发胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，导致基因置换突变，诱发基因表达异常；还可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，导致基因表达不稳定等进而诱发遗传病或肿瘤。
2009年Han等对17例肺癌患者和37名健康志愿者进行研究，采用亚硫酸氢盐处理后测序法检测受试对象EBC中Ras相关区域家族1A基因（RASSF1A）与死亡相关蛋白激酶基因（DAPK）启动子甲基化的情况。结果显示2种基因启动子甲基化程度及空间分布状况有着很大的个体差异；RASSF1A甲基化的程度与受试对象吸烟程度相关；DAPK基因的-63区域的CpG位点在肺癌组和非肺癌组之间存在着差异；启动子甲基化程度与肺癌分期及组织学无相关。这些提示在EBC中检测基因甲基化是可行的，有可能提供关于吸烟暴露及疾病状态等的信息。
3 存在的问题与展望
EBC检测是一种全新的方法，可提供下呼吸道和肺实质的早期病变信号，其收集设备具有便携的特点，收集不受年龄、性别、病情程度的影响，收集过程不会改变呼吸道环境等使得EBC检测手段具有完全无创、简便快捷、可实现实时动态监测等优势，几乎可以应用于所有患者（包括小儿患者、机械通气患者及昏迷患者等）。然而该手段还处于探索的初级阶段，不同学者的研究结论还存在差异，甚至互相矛盾，难以进入临床应用。EBC中所检测到的物质来源的具体解剖定位尚不明了，缺乏特异性；EBC为一高度稀释的体液，其中某些物质浓度极低，不易检测；EBC的稀释度在个体间存在着很大的差异，目前尚缺乏确定EBC稀释度统一的方法，从而可能会影响对检测结果的评估；尚无大规模人群的研究报道，缺乏各种物质在EBC中的正常参考值；研究者所用的设备或收集及检测方法不同，可能得出不同的结果，也使得结果之间缺乏可比性；该方法的重复性和稳定性也需要进一步研究证实。另外，应用该手段进行肺癌诊断的特异性与敏感度仍有待进一步的实验研究，然而随着检测技术的进一步改进及对肺癌发生、发展过程和分子机制研究的不断深入，检测EBC中肺癌相关的生化标记物定能在临床研究肺癌发病机制、肺癌筛查、病情监测、疗效评估和跟踪随访等方面显示出举足轻重的地位。
