1 靶向超声造影剂微泡
分子影像学是指在传统的影像学方法中引入成像造影剂，在分子或细胞水平观察、分析和测量生物体内某一生物学过程或疾病某一阶段特定分子标志物（如肿瘤特异性抗原、血管生成因子和凋亡标志物）的影像学方法。超声分子影像学总的思路设想是：将对组织高度特异的抗体或配体连接于微泡外壳，构筑成靶向超声微泡造影剂，造影剂进入血循环后，依靠抗原、抗体或配体、受体之间的特异性结合，使微泡造影剂主动结合到肿瘤特异分子地址，达到靶向超声分子成像和进一步定量分析的目的。这是超声影像学从非特异性物理显像向特异性靶分子成像的转变，从大体形态学向微观形态学、生物代谢、基因成像等方面发展的一个重要动向。
1.1靶向超声造影剂微泡构建的方法
靶向超声造影剂微泡构建目前主要有两种方式：第1种是微泡壳体成分的化学修饰，如用磷脂酰丝氨酸或其他阴离子脂质附加到壳体。这些修饰放大了补体介导的或整合素介导的黏附反应以非特异性黏附单核细胞和中性粒细胞。这一策略已经被用来检测急性心肌梗死中的炎症反应和移植后的排异反应。第2种是将疾病相关分子（如抗体、多肽、糖蛋白）的配体与造影剂分子表面结合。用于分子成像的超声造影剂（靶向微泡）必须符合以下标准：①用量少（毫克级）；②微泡足够稳定，有充分时间循环到达靶点部位；③在流动状态下可与靶点接触并与之结合，且在结合部位聚集，非靶部位沉积尽可能少；④与靶点结合牢固，在超声成像过程中保持稳定状态，不能在血流作用下分开；⑤价格适中，易于配制，方便储存；⑥微泡表面连接的配体密度足够大。
1.2靶向微泡的构建
靶向微泡造影剂具有靶向性的关键在于将选择性配体连接于微泡外壳，其制备是一个相当复杂的过程。目前配体的连接方法总的又分为两种：第1种是针对小分子配体如肽类、激素等，可事先将其直接或问接结合到成膜材料的的体或分子上，然后按照普通微泡的制备方法，即可获得较为稳定的黏附有配体的靶向微泡。第2种方法适合用于稳定性不高、不能耐受微泡制备过程中所需经历的严峻条件如高速声振、离心或高温，易变性失活的配体如大分子抗体，采取共价或非共价的方式将配体连接到已制备好的微泡表面。其中，非共价结合多通过生物素-亲和素连接技术，而共价结合多采用羧酸酯类衍生物介导配体与微泡外壳连接。另外在脂质微泡的单层外壳与配体之间采用多聚物隔离臂，如聚乙二醇作为连接子，这样微泡的靶向性显著优越于将配体直接连接到外壳的方式。因为聚乙二醇隔离臂如同系绳一样，其系着配体的游离端活动度大，在靶区域能提供配体与受体结合所需的相对较长的接触时间与更多的接触机会；再者，有了连接子后，配体能充分暴露在微泡表面，而直接连接时部分配体可能掩埋在微泡外壳材料之中，造成配体的浪费。另就微泡成膜材料而言，以高分子材料制备微泡相对最具发展潜力，因为高分子材料膜韧性高，抗压性能突出，均一度高，显影时问长，而且尤在携基因或药物治疗中具有极大应用优势。目前的研究倾向用小分子配体取代大分子抗体与微泡连接构建靶向微泡，已有研究报道精氨酸-精氨酸-亮氨酸（RRL）肽、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RCD）肽、P-选择素糖蛋白配体1（PSCL-1）蛋白的糖硫肽片段构建靶向微泡。
1.3超声分子成像的特性
靶向微泡造影剂是纯血管内示踪，因此，最适合探测疾病发生在血管内空间的分子水平的变化，且受微泡大小的限制（微米级），目前主要用于炎症、肿瘤血管生成、血栓、缺血再灌注损伤等方面。超声分子成像的优点是成像速度快（10 min）、能够进行重复注射以完成多目标成像、敏感性强。其缺点是对比增强剂不能进入血管空间以外的病理区域、寿命较短，限制了追踪细胞迁移和生存的能力。血管新生的内皮细胞标记成像或与血管新生相关的免疫反应细胞组分成像，可提供血流改变发生之前内源性或成长因子刺激的血管重建的相关信息。
2 超声分子成像在肿瘤新生血管生成中的研究进展
血管生成在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用，肿瘤细胞通过分泌血管内皮生长因子、成纤维生长因子等因子来控制新生血管的生长，同时通过肿瘤细胞自身相关受体如血管内皮生长受体，整合素受体的高表达，激发血管生长相关信号的胞内转导，进一步促进新生血管的形成，且这类血管生成相关因子及其受体只在肿瘤组织内高表达，成为超声分子显像及治疗肿瘤的靶向作用位点，而在正常组织内很少表达或不易被探及。目前研究认为，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体2（VEGF receptor 2，VFCFR2）信号转导通路和整合素αVβ3细胞黏附分子在调节肿瘤血管生成方面扮演了关键性的角色。目前血管生成相关生长因子及其受体已成为肿瘤分子靶确认的重要分子地址。肿瘤新生血管成像和抑制肿瘤新生血管生成已成为肿瘤诊治研究的主流。
2.1靶向新生血管的超声微泡造影剂种类
Ellegala等将抗αVβ3抗体连接到脂质体微泡表面，利用抗原抗体特异性结合的性质实现了肿瘤靶向超声分子成像的目的。在成功复制大鼠脑胶质瘤模型的基础上，注入靶向超声微泡，在体显微镜下发现靶向微泡更多地聚集在肿瘤微血管内，而非靶向微泡则无此现象；同时观察到靶向微泡信号更多地集中在整合素表达最多的肿瘤周边部位，并且其信号强弱与肿瘤血管内血流量呈显著正相关。Leong Poi等利用人工基底膜Matrigel类似物新生血管生成模型也观察到抗αVβ3整合素抗体修饰微泡造影剂能有效地黏附在肿瘤新生血管内皮上，而菲靶向对照组未见微泡造影剂显像。这些研究结果一致证实了以肿瘤内皮细胞上特异的分子αVβ3靶向肿瘤血管的有效性和可行性。
有研究在大鼠脑肿瘤模型体内注入连接有αVβ3整合素抗体的靶向微泡，观察脑肿瘤模型血管生成。靶向微泡可以特异性与αVβ3整合素结合，免疫组化显示肿瘤周边整合素高表达区域的超声造影信号最强。VEGFR2在多种实体肿瘤中过度表达，是肿瘤新生血管内皮的分子标志物。Willmann等观察到生物素，亲和素法构建的VEGFR2靶向微泡可与裸鼠血管肉瘤细胞特异性结合，靶向微泡超声造影成像结果显示瘤体处超声信号强度显著增高，免疫细胞化学检测和Western印迹分析均证实血管肉瘤细胞高表达VEGFR2，因此VEGFR2靶向微泡超声造影显像可非损伤性地观察动物体内肿瘤血管生成情况。Willmann等在小鼠体内建立肿瘤血管生成模型，将微泡连接于VEGFR2及αVβ3整合素抗体，制成双重靶向超声造影剂用于超声分子显像中，结果表明具有双重靶向性的超声微泡造影剂能使人卵巢癌移植瘤小鼠模型增强显影。Stieger等通过静脉注入表面偶联单克隆抗体或可与表达在新生血管内皮细胞特定分子结合的解离素蛇毒锯鳞蝰素（echistatin）分子的脂质体超声微泡，通过活体显微镜发现，蛇毒锯鳞蝰素和单抗包被的脂质体微泡紧密黏附在微血管内皮上。在此基础上，Stieger等给大鼠皮下注射由肿瘤分泌物的胶状物质，造模10 d后，注入靶向超声徽泡造影剂，发现微泡量与新生血管数密切相关。认为靶向超声微泡造影剂可用于肿瘤血管和组织的显影。
2.2靶向微泡黏附于肿瘤靶标的定量分析
2.2.1 靶向微泡体外寻靶能力的检测：检测靶向微泡体外寻靶能力有两种方式：一种是与体外模型的结合，即将结合靶点包被于塑料或玻璃表面，利用显微镜或超声成像仪器观察靶向微泡在静止或流动状态下与之黏附的情况，发现生物素靶向微泡与亲和素受体体外在流动状态下的结合非常牢固，能耐受高达0.6 m/s的液体介质流速。同时还观察到带有荧光配体的微泡黏附于抗荧光单链抗体（scFv）受体包被的流体腔表面，而对照组非靶向微泡则没有黏附。显微精密测量仪可直接测量微泡.靶点结合力约为数十nN。另一种是与体外培养细胞的结合。多用于活体研究前，检测靶向微泡与表达某一特异分子标志物的体外培养细胞的靶向结合能力。常规超声成像技术可以敏感检测到ng级（约含数千个微泡）的体外微泡，在超声图像上表现为一些亮点。现代的超声成像技术如脉冲反向成像、谐波成像和能量调制成像技术等对检测微泡更加敏感，有研究报道利用脉冲反向成像技术观察到培养皿上pg级的微泡。
2.2.2超声造影微循环灌注定量测量技术用于检测靶向微泡活体的寻靶能力：超声声学造影通过在血液中注入超声造影剂并采用现代的超声造影成像技术，可以在不爆破微泡的情况下获得纯微泡信号，以求提供一种体内微小血管和组织血流灌注的成像与定量测量技术，定量评价恶性肿瘤新生血管形成过程。超声灌注参数定量研究（时间，强度曲线）是利用超声造影微泡灌注动态估计微循环血流灌注。因此，靶向超声微泡造影剂注入肿瘤模型体内数分钟，当血液循环中的自由微泡被清除后，黏附于肿瘤新生血管内皮细胞上的靶向微泡就可以被超声发现，并通过微循环灌注定量测量技术来定量。靶向超声造影微循环灌注定量测量技术的分析指标中HI为造影剂达到组织后，组织开始增强的强度，反映了微泡灌注的初始浓度；PI为组织增强最大强度，反映微泡灌注的最大浓度；FMI为第1分钟组织增强的平均强度，反映第1分钟微泡灌注的平均浓度；FH为第1分钟组织增强的强度积分，反映第1分钟微泡灌注总量；PT为达到PI的时间；AS为微泡由初始浓度到最大浓度的变化速率，反映灌注的速度。那一项或者哪几项参数是敏感的参数是目前需要解决的关键问题。
2.3评估黏附于肿瘤新生血管内皮细胞上的靶向微泡与肿瘤局部病理微血管密度之间的相关性。
肿瘤微血管密度测定是评价肿瘤血管生成的一个重要标准。但定量分析肿瘤新生血管生成目前多采用免疫组化方法进行血管内皮染色，测量肿瘤内“热点”区的肿瘤微血管密度作为血管形成活性的指标。这一指标只能术后获取病理标本后通过免疫组化的方法获得，所得结果仪反映肿瘤较小区域的血管生成情况，无法动态观察，更无法观测功能及肿瘤局部微循环情况，于是能反映肿瘤内微循环变化的功能性影像成为必不可少的无创性疗效评估手段。近年来，研究肿瘤超声造影微循环定量技术所得的单一灌注参数与免疫组化所得微血管密度值之间的相关性取得了很大进展。Palmowski等采用靶向超声造影微循环灌注定量测量技术定量黏附于肿瘤新生血管内皮细胞上的靶向微泡，结果显示与术后所获得的CD31、CD61标记的微血管密度之间具有相关性。靶向超声造影后肿瘤微循环定量测量参数与恶性肿瘤组织增殖活性及其微血管密度的相关性还有待于进一步研究。
3 结语
超声分子成像技术可以无创、快捷、反复、动态，定量评估肿瘤的微血管生成情况，间接反映恶性肿瘤组织增殖活性及其生物学特性，是目前超声分子影像学发展的前沿课题。
