1微小RNA及在胃癌中的表达
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，由具有发夹结构约70 nt的miRNA前体经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA在RNA诱导沉默复合物的引导下，与靶mRNA 3'端非翻译区完全或不完全匹配结合，诱导靶mRNA降解或阻遏其翻译，从而在转录后水平沉默基因的表达，并通过细胞内复杂的调控网络对细胞发育、分化、增殖与凋亡等过程进行精确调节。miRNA基因的缺失、突变、扩增或表观遗传沉默以及生物合成过程中的异常都可能导致miRNA表达水平的改变。胃癌细胞与相应的正常胃黏膜细胞中miRNA的表达分析显示胃癌细胞中miRNA表达情况显著异常。因此，研究特定的miRNA在胃癌发生发展中的作用具有重要意义。
2 胃癌中miRNA与DNA甲基化修饰的相互作用
miRNA根据靶标基因的不同可引起抑癌或者促癌作用。虽然在肿瘤中引起miRNA失调的机制还未完全知晓，但研究显示一些miRNA的失调与表观遗传机制如组蛋白修饰和DNA甲基化密切相关，这些调节机制可以不经DNA序列的变化就使基因表达发生可遗传的改变。DNA甲基化作为重要的表观遗传修饰现象，在肿瘤细胞中经常发生。最新研究表明，与蛋白编码基因一样，miRNA表达同样受DNA甲基化等表观遗传影响。与此同时，miRNA也可能通过多种途径影响DNA甲基化等表观遗传调控机制。
2.1 甲基化调控miRNA在胃癌中的表达
在多数基因的5'端非翻译区和第1外显子区域常会出现高频度的二核苷酸胞嘧啶（CpG）对，这些二核苷酸可以通过调节它们的甲基化状态来控制基因的表达。DNA甲基化将S-腺苷甲基硫胺酸（SAM）的甲基基团连接到CpG岛胞嘧啶环的五碳位置上，整个过程由DNA甲基转移酶（DNMT）催化完成。在一些恶性肿瘤中，启动子区域的异常甲基化可能导致miRNA表达异常，近年来这方面的研究不断增加，证明两者之间存在着复杂的互相调节机制。
2.1.1 超甲基化作用调控胃癌中miRNA的表达：研究者发现在胃癌细胞中，启动子区域CpG岛的超甲基化可抑制抑癌基因的表达，包括编码p16、上皮性钙黏素、基因MLH1、CDHI和APC。同样，研究发现miRNA编码基因启动子序列的CpG岛也可发生DNA的甲基化，这种甲基化修饰可以调控miRNA的表达。Suzuki等发现miR-34b及miR-34c在胃癌中有重要的肿瘤抑制作用，miR-34b及miR-34c在胃癌中表观沉默，并且它们的表达下调与邻近CpG岛的超甲基化密切相关。5-氮-2'-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）及5-氮胞苷（5-Aza-dC）均为甲基化抑制剂，嵌入5-Aza-CdR的DNA与DNMT形成稳定共价复合体，从而导致DNMT活性下降，基因组甲基化相应降低，诱导肿瘤细胞向正常细胞分化或诱导肿瘤细胞凋亡。人们常由经试剂处理前后细胞中miRNA的表达变化情况判断DNA甲基化在miRNA表达中的调节作用。Hashimoto等报道16例原发胃癌组织与相应的癌旁组织对比，其中9份胃癌组织中出现miR-181c表达下降。在一些miR-181c阴性或低表达胃癌组织标本或胃癌细胞株中，观察到miR-181c的上游区域出现了超甲基化信号。检测经5-Aza-CdR处理前后胃癌细胞株KATO-Ⅲ的miRNA表达变化，miR-181c在5-Aza-CdR处理后的KATO-Ⅲ细胞株和其他2个胃癌细胞株及1个结直肠癌细胞株中均出现表达上调，而用miR-181c前体转染2个胃癌细胞株后则出现了生长速度减慢。这些结果均表明DNA甲基化使miR-181c沉默而在胃癌形成过程中发挥了重要作用。Xu等对miR-212的研究也得出了相似结果。
2.1.2去甲基化或低甲基化作用调控miRNA的表达：基因组普遍的低甲基化是肿瘤细胞染色质不稳定和遗传缺失的原因，特异基因低甲基化会引起癌基因激活，被认为是促进转移的重要机制之一。据报道DNA低甲基化同样也参与miRNA的调控。正常情况下，细胞中的let-7 a-3所在CpG岛高度甲基化而致其失活，在肺腺癌细胞中则出现相应CpG岛的低甲基化。用甲基转移酶抑制剂及组蛋白脱乙酰基酶抑制剂（HDAC）联合处理肺癌A549细胞株后出现显著的去甲基化及let-7 a-3表达上调，激活的let-7a-3使近200个基因调节障碍，参与肿瘤的形成。miR-196s由3个HOX簇上的平行基因座编码，属于促进肿瘤形成的miRNA之一。Tsai等发现不同细胞株中miR-196b的表达与甲基化状态密切相关，甲基化沉默细胞经5-Aza-dC处理后则能使miR-196b重新激活转录，在原发胃癌细胞中能观察到miR-196b CpG岛的低甲基化状态，而胃癌中miR-196b表达显著增加，证明胃癌中DNA异常低甲基化能引起miR-196b的过度表达。可见，低甲基化或去甲基化作用也可以增加miRNA分子表达，并参与肿瘤的形成。
2.1.3 miRNA的甲基化调控的影响因素：miRNA的甲基化同时受到其他因素的调控。研究发现DNA甲基化沉默过程通过甲基化CpG结合域（melhyl-CpG-binding domain，MBD）介导与组蛋白修饰紧密联系，DNA甲基化引起的miR-124a沉默常伴随着活化组蛋白标记如乙酰化的组蛋白H3、乙酰化的组蛋白H4、三甲基的组蛋白H3-L4等的缺失，同时也伴有如甲基CpC结合蛋白2（MeCP2）、MBD2等MBD的结合。另外，这些活化的标记和结合的MBD可以通过DNA低甲基化恢复和脱离，DNA低甲基化可由DNMT遗传缺失或5-Aza-CdR处理得到。一些研究表明超甲基化miRNA经24-96 h的5-Aza-dC去甲基化处理后可重新表达，并且如果与HDAC如4-苯丁酸或制滴菌素A联合处理可进一步加强这种表达，进一步表明DNA甲基化和组蛋白修饰作用在肿瘤抑制miRNA沉默中的协同角色。DNMT、去甲基化酶、组蛋白修饰酶等进行不同的组合，导致DNA甲基化状态的多样性，更为精确地调控miRNA表达，从而对细胞的各项生理病理进程产生重要意义。
2.2 胃癌中miRNA对DNA甲基化的影响
miRNA并不只受表观遗传机制调控，也能通过表观遗传修饰调控DNA甲基化和组蛋白修饰过程。最近的研究显示DNMT、HDAC和组蛋白甲基转移酶（HMT）都是miRNA的直接作用靶点，这些分子均涉及包括DNA甲基化在内的表观遗传调节过程。
2.2.1 miRNA通过调节DNA甲基化酶调节DNA甲基化：在哺乳动物中，已经发现DNMT蛋白家族有5个成员，分别是Dnmtl、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L，其中只发现Dnmt1、Dnmt3a及Dnmt3b有甲基转移酶催化活性。DNMT在肿瘤细胞中通常过度表达，被认为是肿瘤细胞出现超甲基化现象的原因之一。一些证据表明DNMT的表达、催化活性及靶专一性都受到基因多重调控，miRNA可以通过调节DNMT影响DNA的甲基化。Fabbri等在研究肺癌中miRNA时发现miR-29s的表达与DNMT-3a、-3b呈负相关，并且miR-29s直接以DNMrl3a、NMT3b为作用靶点。若增强外源性miR-29s在肺癌细胞株中表达能恢复DNA正常的甲基化形式，引起因甲基化沉默的抑癌基因重新表达如脆性组氨酸三联体（FHIT）基因、wwOx（WW domain containing oxidoreductase）基因，并在体内和体外都能抑制肿瘤形成。Ng等在直肠癌研究中发现miR-143将Dnmt3a作为直接作用靶点，可通过抑制其表达发挥其抑癌作用。DuurSma等的研究也表明miRNA可结合于靶基因DNMT-3b mRNA编码区的保守靶序列，调控其表达。
2.2.2 miRNA参与维持细胞中DNA甲基化：Bao等以拟南芥植物为研究对象探索miRNA与PHB基因甲基化之间的关系时发现，miR-165和miR-166是该植物中PHB甲基化所必需，胞质中成熟的miRNA可重新进入细胞核与转录的mRNA配对并进一步结合其他因子而导致结合位点处形成非特异性染色质重构复合物，诱导基因启动子的甲基化。
2.2.3其他：miRNA除了通过以上两种形式来影响甲基化修饰，还可以通过其他途径来调控DNA甲基化。Ting等发现结肠癌细胞株HCT116中突变的Dicer可引起一些基因启动子区域的去甲基化，而此过程中并未影响DNMT活性，提示miRNA或是其他类型的非编码RNA分子通过调节DNMT以外的途径参与了细胞DNA甲基化的调节。Wu等报道了一类新的长度为24核苷酸的miRNA，此长链miRNA通过介导靶标基因DNA的甲基化，在转录水平抑制其表达，进一步阐明了miRNA与DNA甲基化相互作用的多样性。
3临床相关研究
miRNA异常表达与肿瘤发生发展之间的独特联系表明miRNA可能作为肿瘤的一个潜在治疗靶点。一项研究显示化学合成寡核苷酸antagomirs在小鼠体内可作为内源性miRNA的特异性抑制剂，在抗癌治疗中也许可以用来沉默致癌性miRNA如miR-17-92s。另一方面，在肿瘤细胞中有些抑癌性miRNA下调或沉默，如果使这些miRNA重新激活也可能成为抗癌治疗新的研究方向。由于基因启动子区发生甲基化而去表达的基因，经去甲基化处理后可以重新表达，DNA甲基化抑制剂等表观遗传修饰疗法在抗癌治疗中展现了重要的临床前景。Kim等研究发现在胃癌细胞中miR-10b启动子的CpG处于超甲基化状态而使其沉默。胃癌细胞中miR-10b的甲基化状态经5-Aza-CdR处理后明显减少，同时miR-10b表达得到极大恢复。miR-10b在胃癌形成过程中发挥肿瘤抑制作用。事实上，DNA甲基化抑制剂已被美国食品药物监督管理局（FDA）批准用于选择性治疗脊髓发育不良综合征。但仍有许多问题亟待解决，如使DNA甲基化逆转是否会引起其他基因表达的异常等。
4结语
过去几年关于DNA甲基化与miRNA之间相互调控关系的了解有了显著增长，但是在肿瘤发生发展过程中引发DNA甲基化的精确机制还有许多未知之处。相信在不久的将来，DNA甲基化和miRNA在胃癌的早期诊断、治疗、预后判断等方面会发挥更大作用，为人类攻克肿瘤这一难题开辟更新颖更广阔的视野。
