肺癌细胞对3种选择性药物的敏感性
患者，复发性呼吸道乳头状瘤20年，进展侵入双侧肺组织。研究人员利用条件性编程技术将患者的正常组织和肿瘤组织细胞生成细胞培养物。分析显示喉肿瘤细胞包含了野生型 7.9-kb 大小的乳头状瘤病毒 11 (HPV-11) 型基因组，而肺肿瘤组织则包含了10.4-kb 基因组。后者病毒基因组片段的增大是由于启动子和致癌区域的复制。化疗敏感性检查认定vorinostat胶囊是一种潜在的治疗药物。在治疗开始后3个月，肿瘤大小开始稳定，15个月后开始出现持久的抗性。
患者，男，24岁。患复发性呼吸道乳头状瘤20年。患者曾接受多于350次喉消融手术试图控制病毒诱导的肿瘤。此外，患者还经以下几种药物治疗：干扰素（1996至2010年），甲胺喋呤 (2001至2003年), 病变内西多福韦(2007 至 2010年), 以及病变内阿瓦斯汀 (2010年)。以上治疗策略中没有一项可以减缓肿瘤生长并阻止其发展至肺癌，患者分别于1993年, 2000年,以及2007 年行胸廓切开术以切除肿瘤。2010年，CT扫描显示有多个肺部结节加速生长，1个月时间内三项肿瘤大小指标分别增加了 21%, 72%, 和 130% 。在该研究开始阶段，患者行第4次胸廓切开术以切除肺右上页肿瘤，患者被临床归类为耐药性进展性疾病。
根据乔治敦大学医院规则复核委员会提供的草案，患者签署知情同意书后研究人员分离并收集其正常组织和肿瘤组织细胞样本。组织样本通过胶原酶和胰蛋白酶消化分离为单细胞，细胞由新型细胞培养技术培养繁殖，用包含Rho-激酶抑制剂 Y-27632 (Enzo Life Sciences)的培养基共培养，已证实这种培养基可以使上皮细胞快速无限制地体外增殖。本文附录中具体描述了这种新型培养技术。
研究人员利用DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) 从该患者离体培养细胞或组织中进行DNA分离，克隆，以及全DNA测序等工作，并利用滚环扩增试剂盒 (Illustra TempliPhi, GE Healthcare Life Sciences)进行扩增。利用HindIII酶进行酶切并将其连接入pUC19载体。研究人员利用 Primer Walking Services 技术 (Gene wiz)从2个方向对病毒基因组进行测序。
研究人员利用QuickExtract FFPE DNA Extraction Kit (Epicentre)和DNA复制的方法可从上述组织或福尔马林浸泡的石蜡包埋组织中发现病毒基因组，还需要用到 HPV-11 基因组L1基因和通用引物或E1(A)和L1(B) 区域结合处的特异性引物进行PCR扩增。引物序列和PCR方法在附录中有详细描述。
药物检查中所用细胞来自于患者肺癌和癌旁组织，细胞铺入24孔微量滴定板 (BD Falcon) 每孔104细胞。24小时后，细胞用二甲亚砜作为载体，将西多福韦，双氢青蒿素或vorinostat等以不同浓度溶入二甲亚砜处理细胞48小时。之后利用 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)对肺细胞活力进行测定，然后利用 Graphpad Prism4.03版本做sigmoidal浓度反应曲线。
来自手术切除组织的正常细胞和肿瘤细胞培养样本经组织学检查揭示乳头状瘤呈病灶凹细胞非典型性，这一发现与前述喉损伤处的扩散特征一致。肿瘤小部分以及癌旁组织分散成单细胞，研究人员利用新型细胞培养技术进行繁殖。研究人员用8天时间得到细胞培养物并评估HPV基因表达以及肿瘤细胞化疗敏感性（图）。细胞培养物显现出典型的早期上皮克隆物的形态特征；分离自该患者的正常细胞和肿瘤细胞未观察到明显的形态学差异。初级培养物在4天后融合。
出于不同的原因，该患者肺癌细胞中的episomal HPV-11 不可能产生感染性病毒。基因组的大小为10.4 kb, 研究显示 HPV DNA 大于 8 kb 不可能被衣壳蛋白有效包装。已知可被包装的最大乳头状瘤病毒基因组为 8.6 kb。此外，该患者的肺癌细胞不能体外合成 衣壳L1 mRNA ，研究人员必须对肺癌进行免疫组化分析以检查衣壳蛋白。这样，肿瘤在肺部的扩散更可能来自于远端细胞的转移而非新细胞的再感染。最后，喉癌细胞缺乏 10.4-kb 基因组，这预示着病毒基因组的复制并不先于肺癌进行。
