包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）
包被液的准备
多聚-L-鸟氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-鸟氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。
纤维结合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。
包被过程：
1．加入多聚-L-鸟氨酸，至少2～3小时（过夜也行）
2．吸出多聚-L-鸟氨酸
3．加入纤维结合蛋白，大约1～2小时
4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干
5．贮存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。
体外分化方法
第1步：ES培养基
在LIF（ESGRO）存在的条件下维持细胞培养
第2步：EB培养基
使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）
2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液
4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5．2天后更换培养基
将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。
第3步：ITSFn培养基
在最少量培养基中选择神经前体细胞
1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基
2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
第4步：N3培养基＋bFGF
通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
1．PBS洗涤，加入2ml 1×胰酶（1个15cm的培养皿所需胰酶的量根据前文表中的体积）（10×胰酶EDTA用PBS稀释）
2．37℃孵育5分钟
3．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
4．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
5．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
6．2天后更换培养基
第5步：N3培养基
通过撤除bFGF使神经前体细胞分化
1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基
2．根据需要换液（大约每隔一天）
3．分化10～15天后固定细胞
移除培养基
PBS洗涤
加入4%福尔马林
室温放置30分钟
PBS洗涤2次
储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS
四、移植细胞的准备
细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。
移植
1．将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。
细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。
2．去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中
3．离心3分钟
4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml）
5．37℃水浴5分钟
6．加入5mlEB培养基小心吹打约10次
小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
7．离心2分钟
8．吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基
9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
10．离心2次
11．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基
烟酸己可碱标记ES细胞进行移植
1．准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）
2．加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml）
3．将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基）
4．如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液，
5．将悬液置于室温（或冰上）30分钟
6．离心2分钟
7．吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基
8．重复一次
9．离心2分钟
10．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。
主要参考文献：《细胞试验指南》
