胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP)

2012-02-17 00:00 来源:丁香通 作者:
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包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板(使用或不使用盖玻片)

包被液的准备

多聚-L-鸟氨酸,15μg/ml
  把75ml多聚-L-鸟氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。
  纤维结合蛋白,1μg/ml
  把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。

包被过程:

1.加入多聚-L-鸟氨酸,至少2~3小时(过夜也行)
  2.吸出多聚-L-鸟氨酸
  3.加入纤维结合蛋白,大约1~2小时
  4.吸出纤维结合蛋白,放置30分钟晾干
  5.贮存在4℃
  24孔板用200μl,6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。

体外分化方法

第1步:ES培养基
  在LIF(ESGRO)存在的条件下维持细胞培养

第2步:EB培养基

使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
  1.分散纯化细胞(参见上面的细胞传代部分)
  2.纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中,计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
  3.用2mlEB培养基重悬细胞,吹打至少10次制成单细胞悬液
  4.一个15cm的细菌培养皿接种4~5×106个细胞(1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿)。
  5.2天后更换培养基
  将胚状体转入锥形管中放置3~5分钟使细胞沉降。弃去上清,将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
  6.用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中(这即是细胞的移植步骤)。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿,在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。

第3步:ITSFn培养基

在最少量培养基中选择神经前体细胞

1.在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基
  2.并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附,因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
  3.保持细胞在ITSFn中培养大约10天,根据需要更换培养基--大约每隔一天。

观察细胞形态,神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时,转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后,通常是在第3步的第6到第10天。

第4步:N3培养基+bFGF

通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。

1.PBS洗涤,加入2ml 1×胰酶(1个15cm的培养皿所需胰酶的量根据前文表中的体积)(10×胰酶EDTA用PBS稀释)
  2.37℃孵育5分钟
  3.用4mlEB培养基终止胰酶活性,将细胞转入锥形管中放置3~5分钟移出细胞团,将上清移入一新的离心管离心。
  4.将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
  5.将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上(最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板,6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个,以使最大可能的获得样品数量)。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
  6.2天后更换培养基

第5步:N3培养基

通过撤除bFGF使神经前体细胞分化

1.细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基
  2.根据需要换液(大约每隔一天)
  3.分化10~15天后固定细胞

移除培养基

PBS洗涤
  加入4%福尔马林
  室温放置30分钟
  PBS洗涤2次
  储存于PBS。长期储存使用含0.01%叠氮化纳的PBS

四、移植细胞的准备

细胞在胚状体形成4天以后被移植(相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板)。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。

移植

1.将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3~5分钟使胚状体沉降下来。
细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞(包括死细胞)而这些细胞可以被离心下来。
  2.去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中
  3.离心3分钟
  4.去除上清加入1×胰酶(10cm的培养皿加1ml)
  5.37℃水浴5分钟
  6.加入5mlEB培养基小心吹打约10次
  小心处理细胞很重要,进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
  7.离心2分钟
  8.吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基
  9.用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
  10.离心2次
  11.吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基

烟酸己可碱标记ES细胞进行移植

1.准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液(双苯酰亚胺,在冷冻室118)
  2.加入1mg(你能称到的最小量)到5ml EB培养基(制成200μg/ml)
  3.将溶液稀释成10μg/ml (100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基)
  4.如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液,
  5.将悬液置于室温(或冰上)30分钟
  6.离心2分钟
  7.吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基
  8.重复一次
  9.离心2分钟
  10.吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。
主要参考文献:《细胞试验指南》

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编辑: 陈

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