Luminex系统的技术原理与应用

2011-11-03 00:00 来源:路明克斯 作者:
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表1  Luminex液态芯片系统与化学发光/电化学发光仪的主要性能指标比较

性能指标 luminex液态芯片技术 化学发光/电化学发光仪
检测指标   多指标并行检测,1次最多可测500个指标,灵活,按需组合 单指标检测,1次检测1个指标
是否可以做基因检测 可以,如HPV 不可以
试剂成本 比发光法低20%-30%以上 成本高
检测速度 最快可达10000测试/小时 80~150测试/小时
灵敏度、准确性  
重复性  好,每个指标分析100次取平均值 好,每个指标分析1次
是否能扩展为科研平台 非常优秀的科研平台技术,可以自行设计指标。基因和蛋白都可以研究 不可扩展性,不可自行设计指标,不可研究基因

 

4. HPV检测

高危型HPV感染与宫颈癌的发生关系密切。文献报道与宫颈癌有关的高危亚型约有20种。目前用于HPV检测的试剂主要是流式荧光杂交法、固态膜杂交方法和杂交捕获方法三大类,固态膜芯片以导流膜杂交、反向膜杂交为代表,杂交捕获法的代表是美国Digene(现为Qiagen)公司的HC2产品。以膜杂交为基础的方法,其设备费用低廉,使用门槛低。各种膜杂交方法通常采用的是膜片杂交、酶联显色、肉眼或扫描观察颜色深浅来判断结果,而流式荧光杂交法的HPV检测,采用的是微球杂交、激光荧光定量检测、数字信号,相比较而言具有多方面的优势(技术比较,见表2)。

表2 Luminex液态芯片系统与现阶段流行的HPV检测方法的主要性能指标比较

性能指标 Luminex液态芯片技术 导流杂交 反向杂交 HC-II
是否需要洗涤 (反复洗涤带来变异和污染) 多次反复洗涤 多次反复洗涤
结果判断 激光分析,电脑自动得出数字化结果 膜点,肉眼判断颜色深浅 膜点,肉眼判断颜色深浅 显色比例
是否分型
重复性 极好 较差 较差
检测样本数/次 1-96个 15个 20个 45个
污染可能
杂交时间 15分钟 40分钟 2小时或过夜 40分钟

流式荧光杂交法是最新一代的数字化的检测方法,该方法的逐渐应用将使HPV分型检测告别“膜杂交、肉眼判读”的时代。

5. 疫苗效力评价

在用于疫苗临床试验,尤其是评价多价疫苗接种后的免疫应答反应方面,液相芯片技术非常适合同时测定同一血清样本中的多种微生物或多种血清型的特异抗体,与传统的ELISA相比,在检测结果上相关性好,更加灵敏,最低检测浓度可比ELISA低100倍,动态检测范围更宽,不必检测多种稀释度的血清,从而可提高检测的准确性,更能大大减少操作和时间,节约样品用量和费用。例如用液相芯片技术检测肿瘤患者经肿瘤肽疫苗免疫接种后的血清抗肽抗体水平,该方法可迅速、准确地测定这6种抗肽抗体,检测结果与ELISA大致相同,它不仅与ELISA同样灵敏,而且血清样品用量少,检测成本低,耗时短。以检测100种抗肽抗体计算,液相芯片仅需血清1.5 μl,而ELISA需要900 μl;此外,液相芯片成本大约为ELISA的1/10,而检测1000名患者血清所需时间仅为ELISA的1/240。还有许多其它相关研究,如同时定量检测破伤风、白喉类毒素、流感嗜血杆菌B型多糖血清抗体,4种脑膜炎球菌血清型的血清IgG,23种肺炎球菌荚膜多糖血清型特异性IgG抗体等。

6. HLA分型

人类白细胞抗原(HLA)是目前所知人体最复杂的遗传多态系统,HLA不但与个体对某些疾病(如强直性脊柱炎)的易感性有关,其最重要的用途还在于器官移植之前的组织配型。传统的血清学和细胞学配型检测方法耗时较长,难以快速向临床医生报告结果,而液相芯片技术为其提供了一个更好的选择,既可以用血清学方法检测抗HLA抗体,也可用分子生物学方法直接检测等位基因。

利用液相芯片技术进行HLA血清学分型的灵敏度高于ELISA,而且还具有ELISA所不能比拟的高通量、省时和高效率,如ELISA 3 h仅能检测10个标本,而液相芯片可做94个标本,非常适用于临床。

目前市场上用于组织配型的商品化体外诊断试剂盒有One Lambda 公司的LABScreen等,其原理是在微球上交联各种纯化抗原,检测人血清中的HLA Ⅰ类和Ⅱ类抗体。有研究认为液相芯片法检测抗体的灵敏度优于ELISA、补体介导的微量细胞毒试验和流式细胞术。因此,利用液相芯片进行HLA抗体研究的方法在临床上得到了广泛应用

7. 分析基因表达

小分子RNA(miRNA)是一组保守的单链短RNA,约22个核苷酸长度,它们具有重要的基因表达调控作用,是目前各国学者的研究热点。如用液相芯片技术对来自334个标本(包括多种人类肿瘤)的217种哺乳动物miRNA进行了表达分析。观察到miRNA表达谱可反映出肿瘤的细胞来源及分化状态,肿瘤中的miRNA较之正常组织通常下调。将miRNA表达谱成功用于对分化不良的肿瘤进行分类,而mRNA表达谱用于同一标本时却非常不准确。这些发现说明miRNA表达谱具有用于肿瘤诊断的潜力。此外,分析肿瘤相对于正常组织miRNA表达谱的变化还可筛选出感兴趣的miRNA,以深入探讨其在肿瘤发生发展中的作用。  

 8. 遗传病   

许多疾病是多基因遗传性的,也就是说,它们是由多个缺陷基因或由单个基因的多重突变引起的。对于任何一种情况,诊断疾病时,筛查所有已知可能性是非常重要的。这正是以xMAP®技术为基础的多重检测所专长的。因为xMAP®技术可以同时测量100多种不同的分析物。多达50个突变的探针(和相应的正常序列)可以合并在一个反应孔中。例如,Luminex的xMAP®技术用于构建多路技术以检测囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因序列中特定类型的DNA,这些基因的突变会导致囊性纤维化的产生。结果令人非常满意:使用xMAP®技术系统可快速分析,需要的样本量相对较少,能以高分辨率得出可靠的多重CF(Cystic  Fibrosis)基因突变结果。 

9. 生物战争防御   

在911事件发生后,快速检测生物战病原体已成为“反恐”的重要内容。美国Lawrence Livermore实验室已研制出一种病原菌自动检测系统(APDS)。这种预警系统像一个烟雾探测器,能持续监测环境中存在的生物和病原体,如有发现即启动警报。该实验室使用xMAP®技术为APDS开发多重检测方法,能同时检测细菌、病毒和包括炭疽(炭疽杆菌)、鼠疫(鼠疫杆菌)、兔热病(土拉弗朗西斯菌)、SEB(金黄色葡萄球菌肠毒素B)、蓖麻毒素和肉毒杆菌(A型肉毒毒素)在内的生物武器。APDS采用高度灵活且高通量xMAP系统,结合内部控制来确保最高质量的检测。

小结

液相芯片技术以其高通量、准确、快速、灵敏、特异、多重检测、操作简便、可定性定量等显著优点成为一种极具吸引力的大规模生物检测平台,几乎可用于任何分子相互作用的检测。可以预见,随着高特异性、高亲和力抗体的产生以及微球、分析仪器和软件的不断发展改进,能同时检测的指标数目还将不断增加,灵敏度也将不断提高,并逐渐实现仪器微型化和操作自动化,该技术不仅将丰富生命科学研究的实验手段,大大推进基础研究进程,还将在临床诊断、高通量药物筛选、环境监测、农业检测、法医学等领域中掀起一场技术革命。

 

三、硬件平台的最新进展

FLEXMAP 3DTM系统(图2)是继Luminex200系统之后由Luminex 公司全力打造的又一超高通量的检测系统。该系统较Luminex 200在速度、通量和工作性能上都有了很大的改进。FLEXMAP 3DTM系统采用独特的三色染色技术,可同时检测多达500种不同待测物;加之最新的双通道进样系统,使得仪器的分析速度更快,在1h内最多可获得48 000个数据;线性范围更高,可支持高浓度样品的监测需求。

2010年下半年,Luminex公司推出磁珠专用的多重检测系统——MagPix荧光生物反应检测系统(图3)。其检测原理与Luminex200系统、FLEXMAP 3DTM系统有着明显的区别:MagPix系统是一个磁珠专用系统,磁珠与待测物偶联,发生生物化学反应,并发出报告荧光。由于使用了磁性荧光微球,在该系统上使用的试剂和检测,在实验流程上可以省去以往以抽滤为主的洗涤步骤,从而更方便试验人员的操作。该系统适用于核酸、蛋白和配体受体等荧光生物学反应的检测。小巧便携的MagPix,非常适用于爆发恐怖事件或大范围传染病等紧急情况下的快速以及野外现场的检测,也为一些原来从事中低通量ELISA和Western Blot实验的研究工作者提供了一种精度、重复性更高,人力成本更节省的选择。

 

 

 

图2  FLEXMAP 3DTM系统图

 

图3 MAGPIX系统图

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编辑: 陈

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